蛋白质检测（十三）
凝胶迁移或电泳迁移率实验 凝胶迁移或电泳迁移率实验（ EMSA ）是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。通常将纯化的蛋白或细胞粗
蛋白质检测(十二）
七、蛋白印迹实验常见问题及原因分析 1. 没有带？ 原因：样品中抗原含量不足（抗原表达量过低；蛋白降解；上样量不足；样品制备错误）；制胶浓度比例不合适；转膜不完全；一抗
蛋白质检测（十一）
蛋白印迹法 六 显色 3. 碱性磷酸酶缓冲液： 100ml 配方如下。 1mol/L Tris-HCL(pH 9.5) 10ml 5mol/L NaCl 2ml 1mol/L MgCl2 0.5ml DDW 87.5ml * 冷藏保存，可保存数月。 4. 显色液 100BCIP 0.1ml 100×NBT 0.1ml * 显色后
蛋白质检测（十）
蛋白印迹法 六 显色 2. AP 标记二抗 显色液配置 （ 1 ） 100 × 氯化硝基四氮唑蓝（ NBT ）： 10ml 配方如下： NBT 0.33g 70% 二甲基甲酰胺 10ml *1.5ml 离心管分装后冷冻保存，可保存数月。 （
蛋白质检测（九）
蛋白印迹法 六 显色 酶和底物反应显色是蛋白印迹法的最后一步，一般常用酶有 HRP 和 AP ，根据成像底物可分为显色底物和发光底物。发光底物可选用 HRP 标记二抗，显色底物可选用
蛋白质检测（八）
蛋白印迹法 5 实验步骤 （1） 封闭结束后，用 PBS-T 液轻轻清洗膜，去除封闭液。 （2） 用一抗室温孵育 1h 或 4 ℃过夜。 （3） PBS-T 液清洗， 10min ×3 次。 （4） 二抗孵育，室温， 1h 。
蛋白质检测（六）
蛋白印迹法 五 抗原 - 抗体反应 1 仪器和设备 塑料盒、振荡器。 2 封闭 一般采用 5% 脱脂奶粉进行封闭，室温， 30-60min 。 * 封闭液的浓度可以是（ 1%-5% ），根据自己的条件摸索浓度就可
蛋白质检测（四）
蛋白印迹法 三 电泳 * 考马斯亮蓝法：用 40% 双蒸水 /10% 醋酸 /50% 甲醇的溶液固定胶中蛋白 考马斯亮蓝 R-250 染色室温染色 4h 过夜，保持摇匀 转入 67.5% 双蒸水 /7.5% 醋酸 /25% 甲醇摇匀脱色
蛋白质检测三
蛋白印迹法 三 电泳 电泳条件：电压 200V ，电流 8mA ，染料进入分离胶时电流增加到 16mA ，时间一般 2-3 小时。 * 溴酚蓝刚跑出胶即可终止电泳进行转膜，也可以根据时间经验停止电泳。
蛋白质检测二
蛋白印迹法 二 样品处理及上样 1、 取 15-20ug 蛋白，加 2 倍 SDS 上样缓冲液 7ul ， DDW 定容至总体积 14ul 。 * 上样总体积一般少于 15ul ，加样孔的最大限度可加 20ul 样品。 2 、 95 ℃孵育
