双荧光素酶报告基因检测 (miRNA靶基因验证)实验二
实验目的: 验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR的作用位点。
实验材料
1. 质粒与细胞株
pMIR-对照质粒(和元生物);pMIR-TPM1-WT野生型3‘UTR实验质粒(和元生物);pMIR-TPM1-MUT突变型3‘UTR实验质粒(和元生物); pRL-CMV(E2261, Promega);293T细胞株来源于ATCC,细胞培养条件为DMEM+10% FBS+5% CO2。
2. 实验试剂
lipofectamine 2000(11668-019, invitrogen); 胎牛血清(FBS)(SV30087.02,Hyclone); DMEM(12800-017,GIBCO); 胰酶(Trypsin-EDTA)(11668-500,Invitrogen); 24孔板(3524,Corning); miR-X mimics(和元生物);Dual-Luciferase Reporter Assay System(E1910, Promega); Opti-MEM(31985-062, invitrogen)。
3. 仪器设备
荧光显微镜(IX71,奥林帕斯);CO2培养箱(3111,Thermo);生物安全柜(BSC -Ⅱ-A2,上海净化); 低速离心机(TDZ4-WS,上海湘仪); 血球计数板 (REICHERT, Bright-Line); 水浴锅(HWS12,上海一恒);酶标仪(Infinite M1000,TECAN)
4. 统计学处理 GraphPad Prism(Ver5,GraphPad Software) 作图,并进行双侧t检验。
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