从组织分离粗制质膜组分的另一实验方法
Neville(1968) 所述的方法对分离鼠肝质膜的效果较好,但对分离其他组织的质膜不一定适用。这里,介绍一种从其他组织制备粗制质膜组分的方法。
试剂、试剂盒
匀浆缓冲液
仪器、耗材
Dounce 氏玻璃匀浆器(15-ml)带 A 杵
实验步骤
设备
Dounce 氏玻璃匀浆器(15-ml),带 A 杵
试剂
匀浆缓冲液
(配方,见“试剂的配制” PP.234?240)
操作程序
全部操作在 0~4°C 下进行。
1) 在冰冷的匀浆缓冲液屮切碎组织块,倾出血水。用匀浆缓冲液漂洗组织碎块, 并将它们置于冰上。重复上述操作,直至组织碎成 1mm3 大小的碎块,且无可见的血。
2)加入 5 倍(v/v) 于组织块体积的缓冲液,在置于冰浴的 Dounce 氏玻璃匀浆器中用 A 杵抽研 10~20 次,匀浆组织。
3) 匀浆 4°C 下 600 g 离心 10 min。上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶,沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀。
4) 上清下 8000 g 离心 10 min, 沉淀线粒体。弃沉淀。
5) 上清用角转头离心,4°C,100000 g 离心 20 min。弃上清。
6) 用匀浆缓冲液重悬沉淀。在小号 Dounce 氏匀浆器中匀浆,再次 4°C、100000g 离心 20 min。弃上清。
7)用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。
8) 取一小份等分试样作蛋白量测定。粗制的膜可于干冰/乙醇浴中速冻后,保存-85°C。