存在干扰物质条件下的蛋白质浓度测定实验
习惯上,蛋白质的浓度通常是按 Lowry 及其合作者(Lowry 等,1951) 的方法用 Folin-Ciocalteau 试剂进行测定的。但样品中的盐或去垢剂等对这种方法有干扰。Peterson(1977) 介绍了一种改进方法,可部分地解决这些问题。
试剂、试剂盒
试剂 A 试剂 B牛血清白蛋白脱氧胆酸钠 三氯乙酸钠
实验步骤
材料
牛血清白蛋白(BSA)
脱氧胆酸钠(0.15%)
三氯乙酸钠(TCA;72%)
试剂
试剂 A
试剂 B
(配方,见“试剂的配制” pp.234~240)
操作程序
1) 用蒸馏水配制 lmg/mlBSA 溶液,分装,冻存于-20°C 备用。
2) 作标准曲线,于 1.5-ml 微量离心管中配制下列混合物:
3) 用蒸馏水稀释膜蛋白样品(1:10),分別取 5-ul、10-ul、20-ul 等分试样供测定。对于已溶的膜蛋白或 WGA 柱层析组分,不必稀释,取 10ul 即可。另取 10ul 缓冲液于空白对照管,用以测定缓冲液组分的吸收值。
注:如无干扰物质、其含量可忽略或经适当控制,则第 4~8 步可省略。在这样的情况下,用蒸馏水将每个样品稀释至 0.4 ml。
4) 用蒸馏水稀释膜蛋白样品至 1 ml。
5) 每管加 0.1 ml 0.15% 脱氧胆酸钠。混合,室溫放置 10 min。
6) 每管加 0.1 ml 72%TCA。混合,室温下微型离心机离心 15 min。
7) 弃上清。可有效地用吸管吸出。
8) 每管加 0.4 ml 蒸馏水。
9) 每管加 0.4 ml 试剂 A,震荡混匀,室温放置 10 min。
10) 每管加 0.2 ml 试剂 B, 立即混合。室温孵育 30 min。
11)750nm 下读吸光度。
注:在 2 h 之内读吸光度,除非各样品组中都包含有标准蛋白样品。室温下每小时腿色为 1%~2%, 将 8~10 步的体积缩小 10 倍,增加其灵敏度,此法可容易地转为微量测定。除作标准曲线时,蛋白用量减为 0.1~10ug 外,1~7 步均与常量测定同。
12) 以标准样品管中的蛋白量对 750nm 吸光度作图,绘出标准曲线。
13) 根据各被测样品在 750nm 处的吸光度,从标准曲线査出该样品的蛋白含量。
此文转载:丁香通