高手进阶!细胞原代分离最常遇到的问题都在这了
1. 悬浮细胞的分离方法
1) 将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中,1000rpm/分钟离心5分钟。
2) 去掉上清,离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。
3) 用培养基重悬,调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4) 如选用悬液中某种细胞,可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
兔髓核分离中洪实拍操作图
2. 实体组织材料的分离方法
1)机械分散法
a. 纤维成分很少的脑组织,部分胚胎组织,用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
b. 用PBS清洗两次后
①用吸管吹打,分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。
c. 收集细胞转入离心管中,1000rpm/分钟离心5分钟。
d. 去上清,加入含血清的培养基,重悬后移至培养瓶中培养。
2)消化分离法
酶消化分离法(过夜冷消化法)
a. 细胞间质较少的软组织,如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等,用Hanks液清洗组织三次,剪成碎块大小为4毫米左右。
b. 再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
c. 加入0.25%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃过夜。
d. 次日再用Hanks液洗涤,弃去上清,共洗2-3次。
e. 加入少量含血清的培养基吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。
3)非酶消化法(EDTA消化法)
a. 把组织块剪碎,呈1mm3大小的组织块。
b. 将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
c. 加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。
d. 弃去上清,加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应,并洗涤2-3次后,加入完全培养基。
e. 用吸管吹打,使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
神经胶质中洪实拍操作图
常见问题解答:
Q:为什么我取得原代肿瘤组织,分离的却不是肿瘤细胞?
A:取材时,我们要熟悉所需组织的类型和部位特征,选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。
Q:若是细胞中混成纤维细胞,如何去除?
A:成纤维细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于成纤维细胞贴壁速度较肿瘤细胞快,可利用反复贴壁法使二者分离,进而达到清除成纤维细胞的目的。
Q:为什么离心后,没有细胞分离出来?
A:需要考虑消化酶的因素,由于肿瘤组织较致密,胰酶无法消化,一般选用胶原酶,如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法,如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别:
注:胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶,根据分离的组织类型需选择合适的胶原酶类型。
Q:消化时间如何确定?
A:具体的消化酶的量和消化时间可根据组织类型和多少进行调整。
Q:消化之前为什么用EDTA?
A:EDTA是一种非酶消化物,又称螯合剂,对一些组织,尤其是上皮组织分散效果好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后,形成的机械力可使细胞分散。
Q:细胞量太少,长不起来怎么办?
A:有几种办法,如对没消化完的组织块反复消化,尽量多收集一些细胞;并且尽量传代到小皿里,如6孔板都可以。若是细胞仍太少,应耐心等待,尽量不要传代,只换液。
Q:细胞难以贴壁?
A:尽快使接种的细胞贴壁,是决定培养能否成功的关键。为了尽快促进细胞贴壁,可以提前1h将千分之的明胶铺于培养板。
Q:肿瘤原代细胞培养方法与细胞系不同之处在哪里?
A:培养基一般选用RPM1640,DMEM等,建议最好能加入促生长的物质:如胰岛素、氢化可的松、雌激素、EGF等因子。