细胞传代难？过来人教你两招

       悬浮细胞传代

       由于细胞已经在生长培养基中悬浮，所以无需酶的作用使其从培养容器表面脱离，方法简单。通常有两种方法。

       材料准备：

       1、装有悬浮细胞的培养容器。

       2、完全生长培养基，预热至37℃

       3、37℃培养箱，充有二氧化碳浓度为5%的湿化空气。

       传代流程：

       1、直接传代法

       ①   待悬浮细胞长满至80%~90%（细胞悬液变黄），即可传代；

       ②   用吸管吸弃细胞悬液1/2~1/3；

       ③   加入适量的新鲜培养基，继续培养。

       2、离心传代法

       ①   将细胞悬液转移到离心管内；

       ②   150g离心5min，弃去上层清液；

       ③   使用新鲜的培养基重悬细胞；

       ④   吸管吸取适量细胞悬液，装入新的培养瓶，再加入适量的新鲜培养基，继续培养。

       贴壁细胞传代

       贴壁细胞需要用到一种特定的试剂——蛋白酶，其作用是切断细胞和容器之间，细胞与细胞之间的相互粘连，用蛋白酶处理细胞的过程叫做“消化”，“消化”之后的下拨会形成单细胞并从容器底部掉下来。最常用的蛋白酶是胰蛋白酶。

       材料准备：

       1、预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热；

       2、用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；

       3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；

       4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小；

       传代流程：

       1. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
       2. 从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
       3. 将培养瓶放入超净工作台后打开瓶口，同时要在酒精灯上烧口消毒。
       4. 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
       5. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 
       6. 弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。
       7. 将细胞悬液吸入10 ml离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。 
       8. 弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
       9. 将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
       10. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 
       11. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。

       注意事项：

       1、严格的无菌操作。

       2、贴壁细胞消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

       3、传代细胞所有的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作，每种细胞使用一套器材。避免交叉感染。

       4、传代细胞瓶口每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消毒。

       常见问题

       一、发现细胞有污染迹象，应该怎么办？

       一旦发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞。如果必须挽救，可加含抗生素的BBS或培养基反复清洗，随后培养基中加入大量的抗生素，并经常更换培养基。

       二、需要多久更换一次培养基？

       一般2~3天更换一次培养基，这取决于细胞生长速度。

       三、可不可以使用于原先培养条件不同的培养基？

       不能，每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若换了一种培养基，细胞大多不适应，造成细胞无法存活。

       四、可不可以使用与原先培养条件不同的胎牛血清种类？

       不能，胎牛血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以胎牛血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或者内容物上都会有所不同，胎牛血清使用错误也会造成细胞无法存活。

       五、为什么我的细胞总是出现污染？

       细胞培养需要严格的无菌环境，首先检查培养基是否有问题，再检查实验操作过程是否有问题。尤其注意是否吸取液体过快或者操作时手从皿的上方经过造成了污染。

       变化和应用

       现在您知道了如何传代细胞，让我们再来看看传代的一些不同应用。

       我们知道，人类胚胎干细胞是一类必须传代的细胞。它们通常与小鼠成纤维细胞MEF共培养，后者能提供帮助干细胞保持其多能性的因子。

       生长于饲养细胞上的干细胞到了合适的发育阶段时需挑出来。可用微型移液管挑出或用玻璃工具轻轻将其刮下然后接种于新的培养液中进行扩增。

       有一些细胞系对酶消化敏感，或者贴壁很紧无法使用胰酶处理来重悬。细胞刮常用来轻轻将细胞从培养板的底部刮下来。如果细胞贴壁特别紧，可加入培养液或适当溶液后用血清吸管用力刮擦。使用该方法时要小心，细胞比较脆弱，容易在这种机械剥离的方法中受损。

       为了更快并可重复性的大量扩增细胞到超过单层培养瓶容量的规模，可以使用多层培养瓶，它的培养量可达单层培养瓶的3-5倍。

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