富血小板血浆及所含相关因子在临床中的应用

20世纪70年代，Harke等为了避免心脏手术时体外循环造成血小板功能丧失，导致手术后严重出血，分离并提取了富血小板血浆（latelet rich plasma，PRP）并成功应用于心脏外科手术，从此便开始了对PRP的广泛研究。由于PRP含有多种高浓度的生长因子，这些因子之间相互协同作用，有促进组织再生、创面愈合、新生血管形成、减少组织瘢痕增生等作用，并且PRP制作简单，完全来源于人体组织，无免疫排斥反应及传播疾病的风险，在临床中有广阔的应用前景。

 

一、PRP的概念

 

PRP是通过体外离心自体全血而得到的含有高浓度血小板的血浆，主要是通过激活血小板释放多种生长因子而发挥生物学作用。已经证实，PRP中血小板浓度至少要高于生理全血浓度的4倍才被认为是有临床治疗效果的PRP，才能达到治疗目的。体外研究发现，PRP中含有多种生长因子，如血小板源性生长因子，转化生长因子β1和β2，血管内皮细胞生长因子，类胰岛素生长因子和表皮生长因子等。这些生长因子具有促进细胞增殖、分化、趋化和刺激血管生成等多方面的作用。

 

二、PRP的生物作用

 

PRP是通过血小板释放其颗粒内容物到周围环境而发挥其生物作用。PRP在凝血酶及钙离子作用下被激活，导致血小板中的a颗粒发生级联反应并释放多种因子．这些因子包括血小板源性生长因子/转化生长因子β1和β2、血管内皮细胞生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、纤维蛋白、纤维连接蛋白、黏连蛋白以及凝血酶致敏蛋白等。PRP所含的这些生长因子通过跨膜受体立即结合到靶细胞的细胞膜外表面，这些跨膜受体通过诱导激活内源性蛋白信号，进一步激活细胞内第2信号，后者诱导细胞内基因表达，从而导致细胞增殖、细胞外基质形成、胶原蛋白合成等。

 

这些生长因子通过不同途径发挥生物作用，血小板源性生长因子能引起成纤维细胞、平滑肌细胞和单核细胞的增生和游走，并能促进胶质细胞增生；转化生长因子β1和β2对成纤维细胞和平滑肌细胞增生的作用依其浓度而异：低浓度诱导血小板源性生长因子合成、分泌，为间接分裂原，高浓度抑制血小板源性生长因子受体表达，使其生长受到抑制，并且转化生长因子β1和β2促进成纤维细胞趋化，产生胶原和纤维连接蛋白，抑制胶原降解，促进纤维化发生；血管内皮细胞生长因子可促进正常胚胎的发育、创伤愈合及慢性炎性反应时的血管增生，还可以明显增加血管的通透性，进而促进血浆蛋白在细胞基质中沉积，为成纤维细胞和血管内皮细胞长入提供临时基质；此外，类胰岛素生长因子和表皮生长因子在组织再生及创面修复中都起到不可或缺的作用。

 

PRP还含有纤维蛋白、纤维连接蛋白、黏连蛋白和凝血酶致敏蛋白等，它们的作用是连接细胞，对成纤维细胞及上皮细胞的迁徙有重要作用。成熟的成纤维细胞、角质细胞及内皮细胞的细胞膜表面都有相关受体，并且可以与生长因子特异性结合，这表明PRP可以激活不同的细胞参与组织修复和再生。自体PRP对促进组织修复与再生具有独特的优点。PRP中含有多种生长因子，其比例与人体内正常比例一致，所以他们之间能保持着正常的协同作用；PRP可被凝血酶凝固成胶冻状，用在创面上时可以防止血小板流失，使血小板能够长时间地在创面中分泌大量高浓度生长因子，从而避免了液态重组生长因子等试剂极易流失及蒸发的缺点；PRP中含有的大量纤维蛋白，不仅提供了细胞修复和组织再生所需的支架，而且能够促进创面收缩、凝血，加速伤口的闭合；PRP中含有较多的白细胞和单核细胞，有利于防止受损伤组织发生感染。

 

这些生长因子都是通过与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内信号转导，因此，这些生长因子从来没有进入细胞，它们没有致突变性，不会诱导肿瘤的发生。此外，PRP是自源性的，不会出现免疫排斥反应及传播疾病的危险，这保证了其临床应用的安全性。

 

三、PRP的制备

 

目前，PRP的制备方法多种多样，尚未形成统一的标准，其制备方法主要有血浆分离置换法和密度梯度离心法。血浆分离置换法利用医用血分离设备将全血分离制备成血小板血浆和浓缩血小板等，主要应用于血库中血小板的采集及临床成分输血。密度梯度离心法是根据血液中各组分沉降系数的不同，从全血中分离提取出PRP，离心力及离心时间的不同所制备的PRP所含血小板浓度和生物活性也不相同。将采集的自体静脉血采用2次血浆密度梯度离心法获得PRP：第1步为相对低速离心（100 g，离心10 min），使血浆和血小板与红细胞和白细胞分离开；第2步为相对高速离心（400 g，离心10 min），进一步浓缩PRP和分离血小板血浆组分，获得最佳的血小板浓度。离心结束后，根据各成分比重不同从上到下依次分为3层：上层为淡黄色血浆层，中间层为白细胞和血小板，下层为红细胞，吸取中间层混匀即为PRP。PRP在抗凝状态下一般可保存8 h。但目前对是否需要进行第2阶段离心仍存在争议，部分商业化产品均无这一步骤。

 

根据使用目的、制备设备及技术的不同，所制备的PRP含有不等量的血浆、红细胞、白细胞和血小板。因此临床应用和基础研究所用的PRP并不完全相同。根据所含白细胞的多少可以将PRP大致分为2种：贫白细胞的PRP和富白细胞的PRP，两者的制备方法不同。为了更准确地描述PRP的临床应用，2006年Everts等提出了富白细胞的PRP这一概念。因白细胞具有吞噬和免疫作用．为防御反应中极其重要的一环，且白细胞释放出的递质会诱导包括炎性细胞在内的多种细胞聚集和黏附，有利于组织修复，所以富白细胞的PRP有更好的抗炎性反应作用，现在大多数研究文献中所提到的PRP指富白细胞的PRP。与富白细胞PRP相对应的就是贫白细胞的PRP，是指PRP内含有很低浓度或者不含有白细胞。

 

四、PRP的临床应用

 

（一）PRP在整形外科的应用

 

由于PRP含有多种生长因子，这些生长因子具有促进细胞增殖、分化、趋化和刺激血管生成等多方面的作用，因此在整形外科中的研究和应用越来越广泛。2000年，Yuksel等发现类胰岛素生长因子和成纤维细胞生子因子能提高游离脂肪移植成活率，而PRP中含有这2种生长因子，临床实践证明，应用PRP混合脂肪颗粒注射移植于颜面部能提高脂肪组织成活率。PRP含有多种生长因子，具有促进脂肪干细胞分裂、增殖及移植脂肪组织血管化的作用。

 

光老化是一个复杂的过程，细胞外基质的变形、改变和胶原成分的减少是光老化的特点，导致皮肤的强度和弹性降低，PRP中的生长因子具有促进蛋白质的合成、延缓皮肤老化速度、抵抗细胞凋亡和加强组织细胞功能表达的重要作用，Cho等用紫外线照射诱发小鼠皮肤光老化产生皱纹，然后进行PRP抗老化的治疗，治疗后小鼠皮肤皱纹明显减轻，皮肤明显增厚，组织学观察发现成纤维细胞和胶原蛋白明显增加，认为PRP中所含的生长因子刺激成纤维细胞的增殖，从而启动了皮肤修复机制，促进其他细胞的增殖和迁徙，产生胶原和细胞外基质等。

 

由于PRP含有血管内皮细胞生长因子，而血管内皮细胞生长因子可促进正常胚胎的发育、创伤愈合及慢性炎性反应时的血管增生，还可明显增加血管的通透性，促进血浆蛋白在细胞基质中沉积，为成纤维细胞和血管内皮细胞长人提供临时基质，因而可以增强皮瓣血管化。Li等将PRP注入小鼠背部皮瓣，观察皮瓣的成活情况，并与不注射PRP的皮瓣进行比较，发现注入PRP组的皮瓣成活率明显高于其他组，组织学观察发现使用PRP组的皮瓣血管密度明显高于对照组。RT-PCR技术证实，皮下注入PRP的小鼠的血管内皮生长因子的mRNA明显高于对照组，血小板源生长因子表达也明显升高。

 

（二）PRP在慢性难愈性伤口中的应用

 

慢性难愈性伤口是在各种内在或外在因素作用下伤KI不能正常愈合，而进入一种病理性反应状态，从而导致伤口经久不愈，其修复是目前外科学研究的热点和难点，如糖尿病溃疡、褥疮及血管源性、神经源性或放射性慢性难愈性伤口，由于血液供应不足、生长因子缺乏、伤口周同组织活性低，往往久治不愈。PRP中含有多种生长因子，这些生长因子具有促进伤口愈合的作用，为治疗慢性伤口提供了可供选择的方法。

 

2004年Saldalamacchla等开始将PRP凝胶用于治疗糖尿病溃疡，治疗效果明显好于标准治疗组。Crovetti等用PRP凝胶治疗各种皮肤慢性溃疡24例，治疗后肉芽组织开始形成，上皮组织完全再生，并且患者局部疼痛普遍减轻，2例患者经皮瓣移植术后溃疡愈合，他认为PRP凝胶在局部释放多种生长因子共同促进了伤口的修复，如转化生长因子β1、血小板源性生长因子、血管内皮细胞生长因子等。

 

夏江霓等发现，PRP能更好地促进伤口肉芽组织形成，尽管PRP中血小板无细胞核，但静止血小板内保留巨核细胞部分mRNA，具有合成功能蛋白质的能力，如多种生长因子和纤维蛋白等，同时PRP中含有的白细胞参与宿主的炎性反应及免疫反应，促进组织修复与再生，这些因素都能促进慢性难愈性伤口的愈合。

 

（三）PRP在骨科中的应用

 

目前骨组织工程研究大多采用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，由于成人骨髓间充质干细胞采集数量有限，因此需要在体外培养扩增20余天才能达到满足组织T程所需的细胞数量，很大程度上限制了骨组织工程的临床应用。PRP富含各类细胞因子，能够促进多种细胞分裂增殖，其中包括骨髓间充质干细胞，张洪涛等发现采用成人自体PRP对骨髓间充质干细胞的形态无明显影响，却能够明显促进骨髓间充质干细胞的增殖，实验中在较短的时间内骨髓间充质干细胞的数量即增殖到10 7，较常规方法明显提前。说明PRP血清可提供细胞生长所需的各类细胞因子，同时具有促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化和促进细胞增殖的作用。

 

2007年，Sanchez等报道了应用PRP治疗跟腱完全断裂，接受PRP注射的患者未出现伤口并发症，术后早期即恢复了踝关节正常活动范围，并在恢复低强度跑步及正常运动训练所需时间方面均较回顾性对照组显著缩短。骨不连在骨科临床中非常常见，也是骨科医生最棘手的难题之一，Gandhi等对9例足踝骨折术后并发骨不连的患者应用PRP治疗，患者骨不连均愈合，并比较了骨不连及骨愈合患者骨折部位血肿内的生长因子浓度，发现骨不连血肿中的血小板源性生长因子及转化生长因子β浓度均较新鲜骨折明显降低，提示骨不连部位在应用PRP后，其中血小板被激活后释放的生长因子，对促进骨愈合起关键作用。

 

（四）PRP在烧伤治疗中的应用

 

目前临床上多利用包扎及暴露疗法治疗Ⅱ度尤其是深Ⅱ度烧伤创面，治疗时间长，后期可能遗留明显瘢痕，影响容貌及功能。尽管PRP相关制剂已经成功应用于烧伤后的创面修复，但相关的文献报道比较少。Maciel等通过扫描电镜观察PRP对马烧伤创面的修复，发现PRP可以加速细胞外基质的再生及重构，从而促进创面修复，同时减少了创面污染及细菌的繁殖，还发现使用PRP后胶原纤维再生速度明显比对照组快，在实验最后阶段实验组的胶原沉积及组织分布更接近于正常组织，而对照组显得非常杂乱。

 

刘哲伟等从患者自体静脉血提取PRP治疗68例深Ⅱ度烧伤患者，明显缩短了刨面愈合时间，提高创面愈合率，减少换药次数。烧伤后，由于创面存在大量坏死组织，加上机体发生免疫抑制，从而导致细菌附着并大量繁殖。PRP巾含有的白细胞对常见的细菌具有明显的抑制作用，使创面可自我清创．而活化后的血小板是大量生长因子及趋化因子的来源，当烧伤创面经过自我清创后，这些因子就会各自发挥自己的生物作用，修复烧伤创面。

 

（五）PRP在口腔科中的应用

 

Mancuso等采用PRP处理拔牙后伤口，可明显减轻患者的疼痛不适，减少牙槽骨炎性反应的发生，加速伤口愈合．故认为PRP能促进组织的再生修复。有学者把PRP和骨移植材料应用于引导牙周组织再生术，能明显增加附着水平和骨缺损的修复，减少牙周袋深度，具有明确的促进成骨及软组织修复的作用和加速骨愈合的能力，因此，PRP可能具有促进牙周缺损区牙周膜细胞再聚集、增殖、分化等作用。

 

PRP可加速骨沉积的速度和骨生成的质量，治疗所致的种植体周围骨缺损，疗效显著。PRP单独或复合移植材料能提高组织引导再生膜的治疗效果，有效治疗牙周炎造成的骨破坏，改善牙周临床各项指标。罗华渊和牛晓瑁将30例行口腔种植骨患者随机分成实验组（15例）和对照组（15例），对照组仅置人工骨粉，实验组则与富血小板血浆混合使用，术后1～6个月内实验组骨密度均明显提高，且植骨颗粒的清晰度明显下降，发生“毛玻璃样”改变，在高倍镜下能够发现植骨颗粒的边缘附着一些破骨细胞，发生“蚕食样”改变，成骨细胞逐渐形成类骨质，最终慢慢矿化成新生骨，与对照组比较，混合富血小板血浆可显著提高其临床效果。陈姗为口腔种植骨的患者混合植入人工骨粉与富血小板血浆，有效促进了种植体周围骨缺损的修复与骨再生。

 

（六）PRP在其他临床学科中的应用

 

张卫兵等发现，含有多种生长因子的PRP提取液能克服外源性神经生长因子的缺点和不足，具有明显促进周围神经再生的作用。Yol等将PRP用于结肠吻合，特别是伤口愈合不良的患者，获得较好效果。

 

五、问题和展望

 

由于PRP用于临床是近几年才开始，目前在临床应用及研究中还存在许多尚待解决的问题。①PRP的制备尚无统一标准，导致PRP的治疗效果出现差异，需建立一套高效稳定的制备方法，标准化制备的PRP可以为研究与临床应用提供可靠的质量保证。②PRP中不同生长因子的生物学特性、生物学作用及促进组织修复与再生的机制尚未完全阐明。③PRP中血小板激活技术问题还没有完全解决，激活技术决定了伤口处生长因子的数量，即激活后颗粒的释放效率。目前备选激活剂主要是自体凝血酶、异种或重组凝血酶和类凝血酶等物质，具体应用还需要从安全、成本和效果等多方来考虑。④局部使用PRP是否会对整个机体产生不良影响。⑤能否用同种异体PRP取代自体PRP，这样可以减少患者的二次创伤。

 

PRP应用于临床是一种很有前途的生物疗法，其取材方便、无添加材料、无免疫排斥反应，安全可靠、经济有效。随着组织工程、基因工程和细胞分子生物学的不断发展，其临床应用前景会更加光明，将在治疗糖尿病并发症、慢性难愈合创面、急性创伤及运动损伤等方面发挥重要的作用。