Nature：腹泻病原菌的孢子虫遗传修饰

    来自佐治亚大学的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9技术对可引起腹泻病——隐孢子虫病的单细胞微小寄生虫隐孢子虫(Cryptosporidium)进行了遗传改造，由此开创了研究这类病原体的全新时代。他们发表在《自然》(Nature)杂志上的研究结果，最终将帮助学术界和产业界开发出针对隐孢子虫的新疗法及疫苗。

    隐孢子虫通常是通过受到污染的饮用水或是再生水进行传播。当有人吞食下污染水中的成熟卵囊后，在消化液的作用下，子孢子在小肠中脱囊而出，先附着于肠上皮细胞，再侵入其中，可引起严重的腹泻。1993年，在美国的密尔沃基地区由于城市的水处理系统发生故障有40多万人受到隐孢子虫感染。

    在一些资源有限的地区隐孢子虫问题尤为严重，近期的全球研究显示隐孢子虫成为了导致婴幼儿危及生命腹泻的最重要原因之一。当前没有疫苗，仅有一种药物硝唑尼特(nitazoxanide)获得美国食品和药物管理局批准用来治疗隐孢子虫病，无法帮助到那些面对最大威胁的人群：营养不良的孩子及免疫功能低下的患者。

    论文的共同作者、佐治亚大学富兰克林文理学院细胞生物学教授Boris Striepen说：“最大的一个障碍就是很难在实验室中研究隐孢子虫，这使得科学家们和资助机构的回避研究这种寄生虫。新工作为隐孢子虫研究领域打开了一扇研究发现的大门，将促成一些新的急需的治疗方法。”

    研究人员对现有的遗传改造技术进行了一系列的优化，确立了成功瞬时转染隐孢子虫子孢子的基本参数。利用CRISPR/Cas9研究人员能够非常精确地改变隐孢子虫的基因组并观察产生的效应。通过敲除特异的隐孢子虫基因，研究人员可以测试它们对于这种寄生虫的重要性，预测它们作为药物靶点的潜在价值。

    为了确证成功地转染，研究人员还导入了一种标记基因，其编码的荧光素酶基因在有适当底物的情况下会产生生物荧光。通过操控隐孢子虫发光，使得研究人员更易于检测和追踪这一寄生虫。以往研究人员都是在显微镜下检测样本，一个一个地计数隐孢子虫孢子，既费时又不准确。

   现在，只需要简单地检测光研究人员就可以同时测试成千上万的候选药物，看看它们是否能够抑制隐孢子虫生长。

   Striepen说：“现在有相当多的化学药品库可供利用，其中一些化学药品或许可以用于治疗隐孢子虫，这一技术将帮助我们更快速地找到它们。”

   “现在我们已经克服了最初的障碍，获得了很好的机会更快速地向前推进。现在有需要，有机会，也有技术能力，我认为我们或许到达了抗击这一重要疾病的一个转折点。”

    原文标题：Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum

    原文摘要：Recent studies into the global causes of severe diarrhoea in young children have identified the protozoan parasite Cryptosporidium as the second most important diarrhoeal pathogen after rotavirus1, 2, 3. Diarrhoeal disease is estimated to be responsible for 10.5% of overall child mortality4. Cryptosporidium is also an opportunistic pathogen in the contexts of human immunodeficiency virus (HIV)-caused AIDS and organ transplantation5, 6. There is no vaccine and only a single approved drug that provides no benefit for those in gravest danger: malnourished children and immunocompromised patients7, 8. Cryptosporidiosis drug and vaccine development is limited by the poor tractability of the parasite, which includes a lack of systems for continuous culture, facile animal models, and molecular genetic tools3, 9. Here we describe an experimental framework to genetically modify this important human pathogen. We established and optimized transfection of C. parvum sporozoites in tissue culture. To isolate stable transgenics we developed a mouse model that delivers sporozoites directly into the intestine, a Cryptosporidium clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9 system, and in vivo selection for aminoglycoside resistance. We derived reporter parasites suitable for in vitro and in vivo drug screening, and we evaluated the basis of drug susceptibility by gene knockout. We anticipate that the ability to genetically engineer this parasite will be transformative for Cryptosporidium research. Genetic reporters will provide quantitative correlates for disease, cure and protection, and the role of parasite genes in these processes is now open to rigorous investigation.