PPO活性测定

一、原理与方法

      PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

      其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位（U）。

二、仪器与试剂

（1）样品：

      多酚氧化酶粗酶液

      硫酸铵沉淀组分

      DE-52洗脱组分

      葡聚糖凝胶洗脱组分

（2）底物：

      邻苯二酚：O.01M邻苯二酚溶液

（3）反应体系：

      0.2M邻酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8

（4）器皿与仪器：

      试管、恒温水浴等

      分光光度计

三、酶蛋白的比活性

      比活性＝酶活单位（U）/mg蛋白质

四、实验结果与分析

1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）

      结果列表

      试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

      空白 0 0 3 0.16 0.09

      粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03

      1 0.00 0.01 5 0.03 0.01

      2 0.13 0.09 6 0.02 0.02

      分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。

2. DE-52的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）

结果列表

      试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

      空白 0 0 3 0.03 0.05

      粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05

      1 0.00 0.00 5 0.07 0.02

      2 0.03 0.02 6 0.03 0.00

      分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白。

 

 

 

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