生物素酰化探针的检测实验

与放射性标记探针的比活不同，生物素标记探针的可检出性在于每千碱基对中掺入的生物素分子的数量，它可用比色法检测。

比色法

实验材料         DNA

试剂、试剂盒       磷酸酶缓冲液封阻液牛血清蛋白TENBT

仪器、耗材       离心机分光光度计摇床

实验步骤

1.  用DNA稀释缓冲液，稀释生物素酰化标准DNA，浓度为0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同样稀释液处理待测DNA。

2.  对干硝酸纤维素滤膜：每个稀释度取1 μl 点膜，在80℃供干约1 h接步骤4。
 
3.  对于足龙膜：每个稀释度取1 μl 点膜，晾干后用紫外照射法将DNA交联至膜上。接步骤4或化学发光检测。
 
4.  用少量体枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合适大小），用10 ml 封阻液，37℃封闭1 h 注意排出气泡。

5.  稀释10 μl 亲和素-AP交联物至10 ml AP7.5。剪去封闭袋一角挤出封闭液，用亲和素-AP交联物代替，重新封口，在旋转平台室温揺荡10 min。

6.  从袋中取出滤膜移到一个浅盘中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次，10 min，轻微摇荡。

7.  加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混匀。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP，混匀。

8.  在浅盘中避光温育溶液，不时观察直至发色达到满意程度为止。
 

9.  加TE pH8.0以终止反应，比较测定DNA样品和标准DNA的颜色强度以确定生物素酰化dNTP的掺入效率。如果该探计至少有一半标准品的强度，它可作为探针用于原位杂交。

化学发光法

实验材料        DNA

试剂、试剂盒      生物素磷酸酶

仪器、耗材       紫外灯离心机

实验步骤 

1.  用夹子固定已转印的尼龙膜的边角于一小片干的吸水纸上，样品面朝上，放进温箱内12~80℃放15~30 min 或温室晾干过夜。
 
2.  将带核酸的面朝上暴露于紫外灯下，用最适的时间交联。

3.  用生物素探针与膜杂交，用适当强度的洗液洗涤。
 
4.  杂交后、将膜置于杂交袋中。
 
5.  封口，在一个角留有一小孔便于加入和排出液体。

6.  加入1体积的封阻液、室温作1 min 轻微摇动、倒干溶液。
 
7.  加入1 mg/ml 链亲和素至1体积的封阻液至终浓度为1 μg/ml，在杂交袋中室温温育4 min，轻微摇动，倒干溶液。

8.  加入10体积诜液 I，室温洗膜4 min 轻微摇动，倒干溶液，重复1次。

9.  加入生物素酰化碱性磷酸酶至1体积的封阻液，室温作用4 min 轻微摇动、倒干溶液。

10.  用10体积洗液 I 洗膜2次，同步骤8。
 
11.  用0.5体积底物稀释液稀释化学发光底物，在杂交袋中室温作用4 min 轻微摇动，打开杂交袋，尽可能倒干溶液。

12.  压平杂交袋上的折皱，重新封口，结合核酸的一面向上，用一张X光片压好，在暗盒内曝光10~20 min。

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来源：丁香通