LDH（乳酸脱氢酶）法细胞毒性检测
2016-05-25来源：未知
原理：LDH (乳酸脱氢酶） 是稳定的胞浆酶，存在所有的细胞中，当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。 LDH 活性通过两个酶催化反应： LDH 氧化乳酸盐生成丙酮酸盐，然后丙酮酸盐和四唑盐 INT 反应生成甲（ formazan ）结晶。甲（ formazan ）结晶量在培养液中的增加，与裂解的细胞数增加直接相关。甲（ formazan ）结晶染料是水溶的，可以用分光光度计在 500nm 波长检测。通过检测细胞培养上清中 LDH 的活性，可判断细胞受损的程度此分析灵敏、方便、精确，适用于许多种细胞毒性分析。此分析大概需 0.5 － 1h 。
2. 试剂：该检测方法一般有配套的试剂盒，以400T的试剂盒为例，包括以下试剂：
Components 400 assays
Catalyst(Lyophilized) 1 vial
Dye Solution 45 ml
3. 工作液的制备：
a. 用 ddH 2 O 溶解催化剂（ Catalyst ） 10min ，充分混匀。催化剂溶液 4 ℃ 可保存数周。
b. 染色液（ Catalyst ） 4 ℃ 可保存数周。
c. 反应混合液的制备：分析 100 assays ，混合 250ul 催化液和 11.25ml 染色液。混合液现配现用。
4. 细胞毒分析步骤
（ 1 ） 收集细胞，用 1× 分析液（如， 1 ％血清或 1 ％ BSA 培养液）。
（ 2 ） 在 96 孔板中分别制备下列样本：
背景对照： 每孔加 200ul 培养液， 3 个复孔。背景值应从其他值中减去。
低对照： 向每孔 200ul 分析液中加 1 － 2×10 4 细胞， 3 个复孔。
高对照： 向每孔 200ul 含 1 ％ Triton X-100 的分析液中加 1 － 2×10 4 细胞， 3 个复孔。
检测样本： 向每孔 200ul 含检测物质的分析液中加 1 － 2×10 4 细胞， 3 个复孔。
（ 3 ）在培养箱中（ 5 ％ CO 2 ,90% 湿度， 37 ℃ ）孵育细胞，孵育时间为检测物质的适当处理时间。
（ 4 ） 离心细胞 250g ， 10min 。
（ 5 ） 每孔小心转移 100ul 上清到相应的优化清洁 96 孔板中。
（ 6 ） 每孔加入 100ul 反应混合液，室温孵育 30min 。避光操作。
（ 7 ） 用微孔读板仪在 490 － 500nm 检测所有样本的吸光值。参考波长大于 600nm 。
5. 计算细胞毒的百分比：
2. 试剂：该检测方法一般有配套的试剂盒，以400T的试剂盒为例，包括以下试剂：
Components 400 assays
Catalyst(Lyophilized) 1 vial
Dye Solution 45 ml
3. 工作液的制备：
a. 用 ddH 2 O 溶解催化剂（ Catalyst ） 10min ，充分混匀。催化剂溶液 4 ℃ 可保存数周。
b. 染色液（ Catalyst ） 4 ℃ 可保存数周。
c. 反应混合液的制备：分析 100 assays ，混合 250ul 催化液和 11.25ml 染色液。混合液现配现用。
4. 细胞毒分析步骤
（ 1 ） 收集细胞，用 1× 分析液（如， 1 ％血清或 1 ％ BSA 培养液）。
（ 2 ） 在 96 孔板中分别制备下列样本：
背景对照： 每孔加 200ul 培养液， 3 个复孔。背景值应从其他值中减去。
低对照： 向每孔 200ul 分析液中加 1 － 2×10 4 细胞， 3 个复孔。
高对照： 向每孔 200ul 含 1 ％ Triton X-100 的分析液中加 1 － 2×10 4 细胞， 3 个复孔。
检测样本： 向每孔 200ul 含检测物质的分析液中加 1 － 2×10 4 细胞， 3 个复孔。
（ 3 ）在培养箱中（ 5 ％ CO 2 ,90% 湿度， 37 ℃ ）孵育细胞，孵育时间为检测物质的适当处理时间。
（ 4 ） 离心细胞 250g ， 10min 。
（ 5 ） 每孔小心转移 100ul 上清到相应的优化清洁 96 孔板中。
（ 6 ） 每孔加入 100ul 反应混合液，室温孵育 30min 。避光操作。
（ 7 ） 用微孔读板仪在 490 － 500nm 检测所有样本的吸光值。参考波长大于 600nm 。
5. 计算细胞毒的百分比：
细胞毒（％）＝ （检测样本－低对照） / （高对照－低对照） %
此文转载来源： 丁香通
