甲基化检测新方法—近红外荧光成像[创新技巧]

 

      现在发现了一种快速简便的基于NC膜的近红外荧光检测方法研究启动子CpG岛的DNA甲基化。在NC膜上设计捕获探针用于检测DNA甲基化以及由其引起的基因转录水平上的表达变化。这种方法不依赖于重亚硫酸盐处理和PCR扩增，具有更加宽广的动态范围以及相对较高的检测灵敏度。该新方法已经发表在《Analytical Biochemistry》杂志上。

 

      作者研究目的为通过基于NC膜的近红外荧光成像方法检测启动子CpG岛DNA甲基化以及由此引起的转录水平上基因表达变化。文章中作者建立了两套检测体系：DNA甲基化体系和转录体系。检测原理如下图所示：

 

 

                   

 

      图A注解：甲基化检测体系。SS：正义链；AS：反义链。－：阴性对照，不含甲基胞苷的dsDNA。+:阳性对照,含甲基胞苷的dsDNA。IG：抗5-甲基胞嘧啶的抗体；IRDye800CW IgG:抗IgG的近红外二抗。

      图B注解：转录检测体系。G1、G2为检测gene1(GAPDH)转录的两种探针；g1、g2为检测gene2(p14ARF)转录的两种探针。－：阴性对照(不含生物素的dsDNA)。+:阳性对照(含生物素的dsDNA)。

 

      下面我们来看看具体的实验流程：

 

                      

 

 

 

      最终检测甲基化和基因表达时用的仪器为美国Licor公司的Odyssey近红外荧光成像系统。

     认为基于近红外荧光成像的这种检测体系可以快速、高通量并且能准确定量DNA甲基化以及由其导致的转录水平上基因表达的变化。如下图实验结果：

 

 

                     

 

      检测到肿瘤抑制基因p14ARF4个位点均有不同程度的甲基化。第四位点最强，第三位点中等强度，一、二位点最弱。当加入甲基化抑制剂5-aza-CdR以后，第四位点的甲基化减弱，再次证明了该结果的可靠性。

      以上基于近红外检测体系的结果又同时用bisulfite sequencing的方法进行验证，结果如下图所示。与M-NIFA方法得到的结果一致。

 

 

                     

 

      同理，转录水平上基因表达也是同样的方法，Odyssey成像结果以及RT-PCR的验证结果如下图所示：药物处理后，肿瘤抑制基因p14ARF表达上调。RT-PCR与M-NIFA方法得到的结果一致。

 

                       

 

 

      因此：基于NC膜的近红外荧光检测方法可用来检测启动子CpG岛的DNA甲基化以及由其引起的转录水平上基因表达。基于荧光的方法，可对DNA甲基化水平进行定量。不依赖于重亚硫酸盐处理，避免了耗时、对DNA有害、处理效率影响后续分析结果等的弊端，是一种快速有效的DNA甲基化检测方法。

 

 

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