基因扫描：鉴定未知的基因突变位点[创新技巧]

      自从1996年LightCycler实时荧光定量PCR仪上市后，融解曲线分析就成为了实时PCR技术的一个组成部分。SYBR® Green I染料让研究者们不仅可以进行无需探针的定量，还可以通过融解曲线分析的方式直接进行产物鉴定。但是精细的序列识别（如SNP基因分型）还是需要标记探针。用融解曲线分析进行SNP基因分型最初是用一条标记引物加上一条标记探针完成的，后来发展为两条标记探针，每条都是单标记。这些技术今天已经在普通实时定量PCR仪上得到了广泛应用。

      现在，这一技术有了最新的进展。可用于高分辨率融解曲线分析的新仪器和饱和双链DNA结合染料让研究者不用探针即可完成突变扫描和基因分型。高分辨率融解曲线分析最初是用标记引物来完成的（Gundry et al., 2003），用于区分不同的杂合子和纯合子。随后饱和染料的引入让这类实验不再需要任何荧光标记的寡核苷酸（Wittwer et al., 2003）。由于无需进行产物分离，用融解曲线进行突变扫描天生就简单、便宜。其检测杂合SNP的灵敏度和特异性至少跟其他更为复杂的技术一样高（Reed and Wittwer, 2004, Chou et al., 2005）。高分辨率融解曲线分析的应用文献正在急剧增加。目前最重要的一类应用叫做基因扫描，即不通过测序或在测序之前，对PCR扩增片段中可能存在的未知突变进行搜索。其原理就是检测由于突变造成的DNA融解曲线形状变化。要进行这种分析，除了上述的饱和双链DNA结合染料外，还需要具备出色温度均一性的仪器以及精密的分析软件，才能从满天繁星般复杂的数据中解读出特定序列“星座”的信息。

      通过LightCycler® 480实时荧光定量PCR系统平台上引入LightCycler® 480 High Resolution Melting Master试剂和专用的分析软件，罗氏应用科学构建了第一个基于板式实时定量PCR系统的基因扫描解决方案。

      用高分辨率融解曲线法进行基因扫描的优点

      高分辨率融解曲线的特点是高特异性和高灵敏度，而且在大量样本的处理上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析。

      用高分辨率融解曲线分析可用一种染料对任何扩增子上的未知突变进行筛查，不再需要识别不同等位形式的引物或探针，无论突变在扩增片段内的何处，均可检出。

LightCycler® 480基因扫描过程

      在LightCycler® 480基因扫描实验中，样本DNA首先通过实时定量PCR反应进行扩增，体系中含有特定的饱和双链DNA结合染料（如LightCycler® 480 High Resolution Melting Master中含有的）。LightCycler® 480系统通过高频率的数据俘获生成融解曲线，最后使用LightCycler® 480基因扫描软件模块完成数据分析。

LightCycler® 480基因扫描软件模块就是专门开发出来进行高度精确的高分辨率融解曲线分析的。分析分3个基本步骤进行：信号的归一化处理，温度座标平移和差异作图。

                   
 
      图1: 高分辨率融解曲线分析揭示纯合样本与杂合样本差异。（a）扩增子为含有G - T突变的人类红细胞内收蛋白alpha亚基基因ADD1 212 bp片段，来自96份不同的血液样本，使用高分辨率融解染料。（b）差异图形分析可区分纯合样本（野生型或突变型，蓝色）与杂合样本（红色）。

      为什么要选用LightCycler® 480基因扫描平台？

      LightCycler® 480系统是目前唯一将基于高分辨率融解曲线分析的基因扫描作为一个髙通量实时定量PCR整合解决方案提供给客户的平台，同时还包括友好、直观的软件和优化的反应预混液。硬件、软件和含有染料的高分辨率融解反应预混液均以完成研发上市，而且整个系统对基因扫描应用进行了整体优化。全部基因扫描实验可在同一台仪器上完成，样本量一次最高可达384个，2小时内完成所有实验和分析。

      图2: 用扩增子高分辨率融解分析区分纯合子。（a）扩增子为含有G - T突变的人类LPLH3基因163 bp片段，来自96份不同的血液样本，使用高分辨率融解染料。（b）差异图形分析可区分野生型（绿色）、纯合突变型（红色）与杂合突变型（蓝色）。

此文转载来源：生物通