原代细胞培养常见问题

原代细胞与细胞系有什么区别？

 

细胞培养物来源于原代外植体或分散的细胞悬液。通常在这样的培养物中细胞增殖形成汇合地单层细胞或密集地细胞悬液。根据传统定义，第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞[Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]. 这类细胞生命周期有限，在有限的生命周期内需掌握好细胞最大的生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。

 

细胞系是不断生长，分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。实际上，连续细胞系可以用大量次培养基培养，随着代数的增加细胞的基因型和表型都有可能发生改变。

 

需要指出的是，在不同的科研小组中这些术语的定义会有所不同。许多研究员不用细胞系这个词表示细胞群除非细胞经过了遗传改造。

 

2.倍增和代数有什么区别？

 

倍增是培养物中细胞总数加倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。

 

3.接收到的冻存细胞该如何处理？

 

收到包装箱后，立即将冻存细胞从干冰移入液氮中冻存。此过程尽量快以避免升温。不要将细胞储存在-80℃，这样会对细胞造成不可挽回的伤害。

 

4.有多少经验才能开始正常人类细胞培养？

 

推荐有经验者在无菌环境下用层流净化罩工作，如果有经验的话对其它细胞类型也是很有利的。如果你是细胞培养的初学者或打算建立细胞培养实验室，我们会为你提供帮助。请联系我们的细胞培养专家。

 

5.冻存的细胞该如何开始培养？

 

⑴将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。

 

⑵用10秒钟时间将小管的盖子拧松1/4以去除残留在螺纹处的液氮，然后将盖子盖紧。

 

⑶将小管放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体完全融化。

 

⑷将小管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。

 

⑸用70％的酒精冲洗小管，然后擦去多余酒精。

 

⑹打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹。用1ml离心管离心内容物。

 

⑺平衡管内物，用多聚赖氨酸包被培养瓶(多数细胞用T-75的培养瓶)。多数细胞类型推荐接种密度为每平方厘米5000细胞。

 

⑻盖好盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。

 

⑼将培养瓶放放培养箱中(37℃,5%CO2,95%空气)

 

⑽植入培养后第6-16小时更换一次培养基以去除残留的二甲基亚枫和未贴壁的细胞。

 

6.当我第一次植入正常人类细胞时需要旋转细胞去除二甲基亚枫吗？

 

第一次植入正常冻存细胞时，我们不推荐旋转去除二甲基亚枫。离心过程比残留二甲基亚枫对细胞的伤害更大，尤其是不正当的高速旋转。我们的经验是如果二甲基亚枫的浓度很低，细胞不会受毒害。如果你将1ml细胞植入已加入15ml培养基的T-75培养瓶中，二甲基亚枫的浓度将小于0.67％，没有发现负面影响。实际上，如果细胞的接种密度为每平方厘米5000-10000，二甲基亚枫的浓度很低。

 

7.多久更换一次培养基？

 

一般2-3天更换一次培养基，这取决于细胞生长的速度。许多细胞培养实验室通常在周一，周三，周五更换培养基。

 

注意：第一次植入冻存的细胞后，在6-16小时内更换培养基，以去除残留的二甲基亚枫和死亡细胞。

 

8.我能扩培和再冰冻ScienCell的正常人类细胞吗？

 

这取决于细胞类型。一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞不推荐扩培和再冰冻。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等可以扩培和再冰冻。然而，需要注意的是再冰冻的过程可能导致细胞生长性能的改变。如果你想要再冰冻细胞，请亲自咨询我们的技术支持并使用ScienCell SF-CFM，和特定的无血清培养基，以获得最好的效果。

 

9.我能长时间冻存ScienCell的培养基吗？

 

不推荐冻存培养基，冰冻高营养的培养基将导致培养基成分不可逆降解。

 

10.培养瓶中应该加入多少体积的培养基？

 

推荐用量：T-25培养瓶5ml,T-75培养瓶15ml,T-150培养瓶30ml。

 

11.使用你们的专业培养基，还需要另外的补充物吗？

 

ScienCell 公司的培养基是为每一类细胞特定研制的。加入相关的培养成分(生长因子，抗生素和胎牛血清)到基本培养液中，你就得到了完全培养基。其它的不再需要。

 

 

12.完全培养基的保质期是多久？

 

加入所有的补充物后，培养液就成了完全培养基。如果完全培养基储存在4℃条件下，并且每次使用时置于常温的时间尽量少，完全培养基的保质期为6周。

 

13.可以使用自己的或其它公司的培养基培养ScienCell的正常人类细胞吗？

 

ScienCell公司的正常人类细胞使用我们的完全培养基培养并通过测试，细胞已适应此完全培养基。使用其它的培养基，由于需要适应过程可能会导致细胞不良生长。我们推荐使用我们特定的培养基培养正常人类细胞。

 

14.正常人类细胞能传多少代？

 

ScienCell不使用代数描述细胞的生长潜能，因为每一位客户用不同的分流比。ScienCell研究室保证在培养过程中使用我们的培养基和试剂，正常人类细胞达到15倍增倍增(除了在说明书中已指明的)。

 

15.正常人类细胞推荐的分流比是多少？

 

ScienCell 公司不推荐对正常人类细胞使用分流比，因为在用胰酶处理后细胞的产量会有所变化。我们推荐在胰酶作用后对细胞计数，接种密度为5000-10000细胞每平方厘米(在细胞说明书中有推荐接种密度)。

 

16. 可以使正常人类细胞处于实验性饥饿吗？

 

可以将ScienCell 公司的正常人类细胞处于实验性饥饿。细胞在没有添加物的基本培养基中可以维持一段时间，但细胞必须处于良好的环境中。过了这段时期，实验应终止，因为时间过长将导致细胞死亡。最好在实验前测试一下细胞在饥饿条件下能存活多长时间，这取决于多种因素。

 

17. 可以用质粒DNA转染正常人类细胞吗？

 

当然，我们已成功转染了多种细胞，比如皮肤成纤维细胞，肺成纤维细胞，皮肤微血管内皮细胞等等

 基因单核苷酸多态性（SNP）突变检测服务

 

一、 定义:

 

1)一种遗传标记，包括单个碱基的缺失和插入，更多情况是单个碱基的置换。

 

2)通常情况下是一种二等位基因的变异，多为转换，即一种嘧啶碱基换为另一种嘧啶碱基，或一种 嘌呤碱基换为另一种嘌呤碱基，转换与颠换之比为2：1。

 

3)SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C→T，因为CG中C即胞嘧啶常为甲基化的，自发脱氨 后即变为胸腺嘧啶。

 

4)人类基因组SNP位点的数量：目前的估计不完全相同，有人估计每400bp就有一个碱基不同；另一 些人则估计变异频率在0.5‰--10‰。如果假定1/1000的碱基是多态，那么人类30亿碱基中就 有300万SNP位点。

 

5)SNP的分布不均匀，非转录序列中要多于转录序列，绝大多数位于蛋白的非编码区。

 

6)重要性：虽然SNP 不及RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）和短串联重复序列 STR标记变异程度高，但由于数量巨大，分布频密，因此就整体而言，其多态性要高得多。

 

7)检测方便：大多为二态，便于自动化批量检测。

 

二、 方法 DNA序列分析（DNA sequencing） 应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％

 

主要有两种方法：

 

1,测序法：现在的测序方法已与经典的方法有了很大的不同，其基本原理虽仍是双脱氧终止法，但自动化程度大为提高，操作更简便，测序时间也大大缩短。随着PCR技术与测序联合使用，不需经过M13亚克隆步骤，故称为直接测序法（direct sequencing,DS）。

 

2,探针法：实验原理：探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。在探针的5’端使用不同的Report荧光基团，单一PCR中可以检测到多个探针的杂交与相应荧光。只有与模板完全匹配的TaqMan探针在与等位基因发生特异性杂交后，利用Taq酶的5’外切酶活性作用使得探针的5’Report荧光能够被检测。

 

实验步骤如下：

 

(1)客户收集标本(血液或组织等标本);

 

(2)确定基因突变SNP位点, 设计合成特异PCR扩增普通引物及探针,并在NCBI网站做BLAST;

 

(3)进行PCR扩增,通过SNP分型获得实验报告;

 

(4)分析报告,给出实验结果;

此文转载来源：生物帮