定量蛋白质组学之SILAC技术（三）[创新技巧]

       很多小分子化合物具有特殊的活性基团，可以结合某些特定的蛋白或核酸，激发或者抑制生物大分子的活性，从而影响生命的过程。人体内种类繁多的维生素类、辅酶等物质就是这些活性小分子化合物。在药物方面，有很多药都是一些有着特殊活性的小分子化合物，分子量从200 Dalton到数千Dalton。因此，小分子药物筛选、优化和药物机理研究成为了制药和药理学研究的重点。目前关于这方面研究的手段，从不同的目的出发有不同的方法。但如果要测定某些化合物和靶蛋白之间的相互作用动力学和亲和力，最好的办法非SPR技术莫属。

 

       ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统是Bio-Rad公司2007年隆重推出的新一代SPR生物传感器。它具有6×6的芯片格式，可以在芯片上同时或分次固定6种蛋白（ligand），然后化合物（analyte）以6种不同的浓度平行地流过所有ligand，36对相互作用的反应曲线同时记录，同时分析。只需一次进样就可以分析一种药物和多种不同靶蛋白之间相互作用的动力学和亲和力常数。这种分析方法不仅大大提高了分析速度，而且由于分析的时候多个浓度、多个不同的ligand和analyte是在完全相同条件下反应的，得到的结果最准确，重复性也最好。点击索取更多技术资料！

 

       ProteOn XPR36系统分析小分子化合物采用灵敏度最高的GLH芯片。这种芯片的基质较长，羧基位点较多，因此能结合较多的ligand蛋白，而且蛋白活性保持较好。这样的芯片能够产生较高的反应信号，非常适合分析小分子化合物。以下是使用该款芯片分析蛋白和小分子化合物相互作用的几个例子：

CAII蛋白和小分子抑制剂的相互作用：

       首先将CAII蛋白标记在GLH芯片上。采用氨基偶联，将CAII蛋白用pH 5.0的NaAc溶解，标记在芯片上，可达21,200 RU。待基线稳定后再上小分子抑制剂溶液。待反应全部结束后，用ProteOn Manager软件分析结果。反映曲线如下：

       以上实验用的小分子化合物分子量非常小，因而信号比大分子蛋白要低很多。GLH芯片通过增大标记量，有效地提高了反应的信号，而且得到的结果与前人用传统的芯片分析得到的结果均相符。同时需要指出，所有这些反应，都是在一两天的时间内完成的，大大缩短了分析时间。

 

       Anti-DNP抗体和DNP标记氨基酸的相互作用分析：

       如果作为ligand的蛋白分子非常大（超过100kD），那么这些分子在标记的时候用于空间位阻的关系，会占据基质的多个结合位点，导致标记效率下降。为此，很多人用ligand和analyte分子量之比来衡量芯片或仪器的灵敏度。GLH芯片可以达到400倍的检测灵敏度，也就是说，即使ligand分子比analyte分子的分子量高400倍，也依然可以检测到相互作用。为此，我们设计了一个小分子抗体（约150 KD）和几个抗原之间的相互作用实验。每个实验的具体信息和反应曲线见下表和下图：

      上面的例子都是检测分子量仅有二、三百的小分子化合物，而抗体分子量很大。实验中抗体标记了18550RU，因此可以检测到分子量相差如此之大的analyte。

 

       CAII蛋白的标记活性测定

       在小分子化合物检测中，作为ligand的蛋白活性对于检测的灵敏度影响非常大。很多人在做SPR实验的时候往往都会忽视这个问题，因为许多实验都不像SPR对蛋白活性如此敏感。在上面两个实验中，如果蛋白活性丧失超过1/2，很难想象还如何检测到这么小分子量的化合物。可问题在于，氨基偶联几乎不可避免地会造成蛋白活性的降低，主要原因可能是部分蛋白的活性位点被芯片上的基质所覆盖。为此，我们又设计了一个实验，就是根据许多化合物和CAII相互作用的Rmax值，推算GLH芯片上有活力的蛋白信号，最后和标记时直观看到的标记信号做一个比较，就可以计算出蛋白标记后的活力占总蛋白的比例。

 

       这个实验的方法是，把CAII蛋白标记在GLH芯片和一种传统基质的芯片上，分别测定一系列化合物反应的Rmax值，然后根据两个分子的分子量和结合比，推算出蛋白的活性。每一个实验测得的蛋白活性都不完全一样，对这些数据进行线性回归，可以得到活性的平均值。见下图：

       上图中，我们可以看到，GLH芯片上蛋白活性较高，达到了85%，而传统芯片上蛋白活性只有46%，也就是说，一大半蛋白在标记的过程中丧失了活性。GLH芯片上的蛋白活性高，意味着能结合analyte的分子更多，产生的信号更高，灵敏度也就更高。

 此文转载来源：生物通