植物病原细菌及其所致病害症状观察
2016-05-25来源：未知
一、实验目的
细菌是引起植物病害的又一类重要的病原生物，虽不象植物病原真菌种类那样繁多，但因其个体微小，形态差异不够明显，所致病害症状复杂，都给细菌病害的研究带来一定的困难，病原细菌的形态观察和分类鉴定需要特有的实验技术，通过本次实验，掌握植物细菌病害的分类鉴定需要特有的实验技术，熟悉植物细菌病害症状类型和病原细菌的基本形态，学习植物细菌病害简易诊断方法及病原细菌初步鉴定的程序和技术，为以后植物细菌病害的正确诊断和病原细菌的分类鉴定打下良好的基础。
二、内容、材料和方法
（一）植物细菌病害的症状观察
植物细菌病害的症状常作为鉴定属的一种辅助性状，即症状类型和病原属之间有一定的相关性，如棒杆菌属的细菌主要引起萎蔫症状；假单胞杆菌属主要引起叶斑，腐烂和萎蔫症状；黄单胞杆菌属主要引起叶斑和叶枯症状；野杆菌属引起瘤肿等增生性症状；欧氏菌属一般引起软腐，有时也引起萎蔫。此外，多数细菌病害在发病初期，特别在潮湿的自然条件下常呈水浸状或油渍状；在饱和湿度下病斑上常有菌脓形成，干后成为菌痂，掌握症状类型(附1)及其形成的生态条件，对细菌病害的正确诊断是十分重要的。观察下列病害标本，区分症状类型。
水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae)
棉花细菌角斑病(X.malvacearum)
马铃薯环腐病(Clavibacter sepedonicum)
白菜软腐病(Erwinia carotovora)
黄瓜细菌角斑病(Pseudomonas lachrymans)
苹果根癌病(Agrobacterium tumefaciens)
大豆细菌性斑点病(P.glycinea)
挑细菌性穿孔病(X.pruni)
菜豆细菌性叶烧病(X.phaseoli)
水稻条斑病(X.oryzicola)
（二）植物细菌病害的简易诊断
植物细菌病害的诊断和病原鉴定是比较复杂的，初步诊断是根据症状特点和显微镜检查病组织中的细菌来完成的，细菌病害，除少数(如苹果根癌病)外，绝大多数能在受害部位的维管束或薄壁细胞组织中产生大量的细菌，并且吸水后形成菌溢，因此，镜检病组织中有无细菌的大量存在(菌溢的出现)是诊断细菌病害简单易行的方法。
取水稻白叶枯病新病叶，在病斑病健交界处剪取2×2 mm的小块病组织，放在载玻片上，滴加一滴蒸馏水，盖好盖玻片后，立即在显微镜下观察，注意叶组织维管束剪断处是否有大量的细菌，呈云雾状溢出，如将视野调暗观察更易见到，按同样方法用健康组织作镜检反证。
（三）植物病原细菌形态观察和种类鉴定
细菌个体很小，无论形态观察还是种类鉴定，都须经染色后才能在显微镜下观察清楚，植物病原细菌目前发现的只有五个属：属的鉴定主要根据革兰氏染色反应，鞭毛数目和着生位置，菌落颜色及所致病害症状等进行。
1. 培养性状观察
取培养皿中培养的水稻白叶枯病菌(X.oyzae)、马铃薯环腐病菌(C.sepedonicum)，茄青枯病菌(Burkholderia solanacearum)和白菜软腐病菌(E.carotovora)等，注意观察菌落颜色、大小、质地，是否产生荧光色素等，和植物病原真菌培养菌落有什么根本性的不同?
2. 染色反应观察
（1）革兰氏染色反应
供试菌种：马铃薯环腐病菌(C.sepedonicum)和白菜软腐病菌(E.carotovora)。
操作步骤：
A 涂片方法
a、取洁净的载波片，加一滴无菌水；用移菌环按无菌操作要求取一环菌苔，在水滴中制成菌悬液；
b、另取一洁净载玻片，在中央加滴无菌水，取一环上述配制的菌悬液至水滴中，均匀涂布成薄层后，自然晾干；
c、将涂片在灯焰上缓慢通过2-3次进行固定。
B 染色步骤
a、滴草酸铵结晶紫液于涂片上，染色1分钟；
b、倾去染液，水洗(亦可不用水洗)；
c、加碘液处理1分钟；
d、倾去碘液、水洗、吸水纸吸干；
e、用95%酒精洗脱染液，时间约30秒钟；
f、吸干后，滴加复染剂藏红复染10-30秒钟；
g、水洗、吸干镜检。
阳性反应的细菌染成紫色，阴性反应的染成红色，注意涂片菌液不能太浓，其次褪色要彻底。否则是红是紫不易区分。
（2）鞭毛染色
细菌鞭毛很细(只有0.02—0.03微米)。不做特殊处理，一般光学显微镜是看不见的，鞭毛上沉积了染剂或银盐后才能看到，这是所有鞭毛染色的根据。但是染剂也可以在载玻片上沉积，如果载玻上沉积染剂太多，就会影响鞭毛染色效果。为此所用载玻片一定要用特殊方法严格洗涤(方法这里从略)，此外染剂处理时间一定要严格掌握处理时间，处理时间太短，鞭毛上没有足够的沉积物看不清楚；处理时间太长，玻片上沉积物太多，也看不清楚。第三，菌龄十分重要，培养时间不足，或培养时间太长都不易染色成功，不同种类的细菌培养时间差异较大，白菜软腐病菌以在26—28℃恒温箱中培养16—18小时为宜，总之，鞭毛染色比较困难，必须严格掌握每个操作环节。
供试菌株：白菜软腐病菌(E.carotovora)
操作步骤：
A、载玻片准备
用新的载玻片，经过系列清洁处理(方法从略)后，进行检验，合格者用于实验。
B、细菌悬液的配制
供染色用的菌种，用前每隔1-2天转移一次，连续转移几次进行活化，增强细菌的活性。在已活化并在16-28℃恒温箱中培养16-18小时的白菜软腐病菌斜面上加3-5毫升先在恒温箱中经予热的无菌水，静置10-20分钟，使细菌游出配成稀薄的菌悬液，注意静置的时间不能太长，因为时间长了鞭毛可能脱落、染色固定前可在镜下观察其游动性。
C、涂片
用移置环取配好的菌悬液2-3环于洁净的载玻片上，立即将玻片直立，使菌液流下展开，在玻片上遗留并形成菌悬液膜，在空气中自然干燥固定，勿用火焰固定。
D、染色
鞭毛染色的方法很多，大致可分为两类，第一类是碱性品红染色法；第二类是银盐沉积法，本次实验用银盐沉积法或碱性品红染色法。
细菌是引起植物病害的又一类重要的病原生物，虽不象植物病原真菌种类那样繁多，但因其个体微小，形态差异不够明显，所致病害症状复杂，都给细菌病害的研究带来一定的困难，病原细菌的形态观察和分类鉴定需要特有的实验技术，通过本次实验，掌握植物细菌病害的分类鉴定需要特有的实验技术，熟悉植物细菌病害症状类型和病原细菌的基本形态，学习植物细菌病害简易诊断方法及病原细菌初步鉴定的程序和技术，为以后植物细菌病害的正确诊断和病原细菌的分类鉴定打下良好的基础。
二、内容、材料和方法
（一）植物细菌病害的症状观察
植物细菌病害的症状常作为鉴定属的一种辅助性状，即症状类型和病原属之间有一定的相关性，如棒杆菌属的细菌主要引起萎蔫症状；假单胞杆菌属主要引起叶斑，腐烂和萎蔫症状；黄单胞杆菌属主要引起叶斑和叶枯症状；野杆菌属引起瘤肿等增生性症状；欧氏菌属一般引起软腐，有时也引起萎蔫。此外，多数细菌病害在发病初期，特别在潮湿的自然条件下常呈水浸状或油渍状；在饱和湿度下病斑上常有菌脓形成，干后成为菌痂，掌握症状类型(附1)及其形成的生态条件，对细菌病害的正确诊断是十分重要的。观察下列病害标本，区分症状类型。
水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae)
棉花细菌角斑病(X.malvacearum)
马铃薯环腐病(Clavibacter sepedonicum)
白菜软腐病(Erwinia carotovora)
黄瓜细菌角斑病(Pseudomonas lachrymans)
苹果根癌病(Agrobacterium tumefaciens)
大豆细菌性斑点病(P.glycinea)
挑细菌性穿孔病(X.pruni)
菜豆细菌性叶烧病(X.phaseoli)
水稻条斑病(X.oryzicola)
（二）植物细菌病害的简易诊断
植物细菌病害的诊断和病原鉴定是比较复杂的，初步诊断是根据症状特点和显微镜检查病组织中的细菌来完成的，细菌病害，除少数(如苹果根癌病)外，绝大多数能在受害部位的维管束或薄壁细胞组织中产生大量的细菌，并且吸水后形成菌溢，因此，镜检病组织中有无细菌的大量存在(菌溢的出现)是诊断细菌病害简单易行的方法。
取水稻白叶枯病新病叶，在病斑病健交界处剪取2×2 mm的小块病组织，放在载玻片上，滴加一滴蒸馏水，盖好盖玻片后，立即在显微镜下观察，注意叶组织维管束剪断处是否有大量的细菌，呈云雾状溢出，如将视野调暗观察更易见到，按同样方法用健康组织作镜检反证。
（三）植物病原细菌形态观察和种类鉴定
细菌个体很小，无论形态观察还是种类鉴定，都须经染色后才能在显微镜下观察清楚，植物病原细菌目前发现的只有五个属：属的鉴定主要根据革兰氏染色反应，鞭毛数目和着生位置，菌落颜色及所致病害症状等进行。
1. 培养性状观察
取培养皿中培养的水稻白叶枯病菌(X.oyzae)、马铃薯环腐病菌(C.sepedonicum)，茄青枯病菌(Burkholderia solanacearum)和白菜软腐病菌(E.carotovora)等，注意观察菌落颜色、大小、质地，是否产生荧光色素等，和植物病原真菌培养菌落有什么根本性的不同?
2. 染色反应观察
（1）革兰氏染色反应
供试菌种：马铃薯环腐病菌(C.sepedonicum)和白菜软腐病菌(E.carotovora)。
操作步骤：
A 涂片方法
a、取洁净的载波片，加一滴无菌水；用移菌环按无菌操作要求取一环菌苔，在水滴中制成菌悬液；
b、另取一洁净载玻片，在中央加滴无菌水，取一环上述配制的菌悬液至水滴中，均匀涂布成薄层后，自然晾干；
c、将涂片在灯焰上缓慢通过2-3次进行固定。
B 染色步骤
a、滴草酸铵结晶紫液于涂片上，染色1分钟；
b、倾去染液，水洗(亦可不用水洗)；
c、加碘液处理1分钟；
d、倾去碘液、水洗、吸水纸吸干；
e、用95%酒精洗脱染液，时间约30秒钟；
f、吸干后，滴加复染剂藏红复染10-30秒钟；
g、水洗、吸干镜检。
阳性反应的细菌染成紫色，阴性反应的染成红色，注意涂片菌液不能太浓，其次褪色要彻底。否则是红是紫不易区分。
（2）鞭毛染色
细菌鞭毛很细(只有0.02—0.03微米)。不做特殊处理，一般光学显微镜是看不见的，鞭毛上沉积了染剂或银盐后才能看到，这是所有鞭毛染色的根据。但是染剂也可以在载玻片上沉积，如果载玻上沉积染剂太多，就会影响鞭毛染色效果。为此所用载玻片一定要用特殊方法严格洗涤(方法这里从略)，此外染剂处理时间一定要严格掌握处理时间，处理时间太短，鞭毛上没有足够的沉积物看不清楚；处理时间太长，玻片上沉积物太多，也看不清楚。第三，菌龄十分重要，培养时间不足，或培养时间太长都不易染色成功，不同种类的细菌培养时间差异较大，白菜软腐病菌以在26—28℃恒温箱中培养16—18小时为宜，总之，鞭毛染色比较困难，必须严格掌握每个操作环节。
供试菌株：白菜软腐病菌(E.carotovora)
操作步骤：
A、载玻片准备
用新的载玻片，经过系列清洁处理(方法从略)后，进行检验，合格者用于实验。
B、细菌悬液的配制
供染色用的菌种，用前每隔1-2天转移一次，连续转移几次进行活化，增强细菌的活性。在已活化并在16-28℃恒温箱中培养16-18小时的白菜软腐病菌斜面上加3-5毫升先在恒温箱中经予热的无菌水，静置10-20分钟，使细菌游出配成稀薄的菌悬液，注意静置的时间不能太长，因为时间长了鞭毛可能脱落、染色固定前可在镜下观察其游动性。
C、涂片
用移置环取配好的菌悬液2-3环于洁净的载玻片上，立即将玻片直立，使菌液流下展开，在玻片上遗留并形成菌悬液膜，在空气中自然干燥固定，勿用火焰固定。
D、染色
鞭毛染色的方法很多，大致可分为两类，第一类是碱性品红染色法；第二类是银盐沉积法，本次实验用银盐沉积法或碱性品红染色法。
银盐沉积法：滴甲液3-5分钟，用蒸馏水轻轻冲洗甲液，再加乙液，处理30-60秒钟，立即用蒸馏水轻轻冲洗乙液，空气中自然干燥后，镜检(有人在加乙液后，在灯焰上微加热，再用水洗)菌体染成深褐色，鞭毛染成褐色，注意鞭毛数目及着生方式。
此文转载来源：丁香通
