细菌DNA PCR反应模板的制备
2016-05-25来源：未知
从分析的标本中纯化核酸，即制备PCR反应的模板，是使PCR获得成功的重要的第一步。由于PCR的用途各异，用于抽提核酸的起始材料种类可能差异很大（包括新鲜的、储存的和古代的）。每种特殊样品类型有各自的限制和抽提核酸的不同要求，但它们都有一个共同的标准，扩增的灵敏性要求特别注意不同材料、PCR产物、质粒或对照之间可能存在的交叉污染。由于PCR不需要高分子量和高度纯化的核酸，为最大限度材料污染的机会，可以使用快速而且简便的提取方法。
【试剂与配制】
TE缓冲液（pH8.0）
裂解缓冲液：2%SDS，10μg/ml蛋白酶K溶于TE中。
RNase A （10mg/ml）
平衡酚
氯仿：异戊醇（24：1）
无水乙醇
70% 乙醇
3mol/L 乙酸钠（pH5.2）
【操作方法】
1、方法一
（1）从平板上挑取至少1.5mm的菌落到一微量离心管中，加入400μl裂解缓冲液，混匀；
（2）55℃～60℃，水浴15～20min；
（3）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀；
（4）5000g离心10min；
（5）吸取上层水相，再加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）；
（6）重复（3）～（4）；
（7）吸取上层水相，加1/10体积3mol乙酸钠及RNase A（终浓度为0.25～0.3μg/μl），轻摇，37℃保温30 min；
（8）加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃ 2hr；
（9）10,000g 离心15min，弃上清，或用无菌细玻棒搅缠出DNA；
（10）70% 乙醇洗2次，待乙醇蒸干后重新溶于小体积去离子水或TE缓冲液中（约20μl）。一次取5～10μl进行PCR反应。
2、方法二
（1） 取一定数量的细菌加入500μlTE缓冲液中；
（2） 100℃煮沸10min，置冰浴保存；
（3） 10,000rpm，4℃离心10min；
（4） 取适量上清作为PCR 模板。
3、方法三
（1） 制备一定浓度的细菌/去离子水悬液，反复冻融3次；
（2） 10,000rpm，4℃离心10min；
（3） 取适量上清作为PCR 模板。
【试剂与配制】
TE缓冲液（pH8.0）
裂解缓冲液：2%SDS，10μg/ml蛋白酶K溶于TE中。
RNase A （10mg/ml）
平衡酚
氯仿：异戊醇（24：1）
无水乙醇
70% 乙醇
3mol/L 乙酸钠（pH5.2）
【操作方法】
1、方法一
（1）从平板上挑取至少1.5mm的菌落到一微量离心管中，加入400μl裂解缓冲液，混匀；
（2）55℃～60℃，水浴15～20min；
（3）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀；
（4）5000g离心10min；
（5）吸取上层水相，再加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）；
（6）重复（3）～（4）；
（7）吸取上层水相，加1/10体积3mol乙酸钠及RNase A（终浓度为0.25～0.3μg/μl），轻摇，37℃保温30 min；
（8）加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃ 2hr；
（9）10,000g 离心15min，弃上清，或用无菌细玻棒搅缠出DNA；
（10）70% 乙醇洗2次，待乙醇蒸干后重新溶于小体积去离子水或TE缓冲液中（约20μl）。一次取5～10μl进行PCR反应。
2、方法二
（1） 取一定数量的细菌加入500μlTE缓冲液中；
（2） 100℃煮沸10min，置冰浴保存；
（3） 10,000rpm，4℃离心10min；
（4） 取适量上清作为PCR 模板。
3、方法三
（1） 制备一定浓度的细菌/去离子水悬液，反复冻融3次；
（2） 10,000rpm，4℃离心10min；
（3） 取适量上清作为PCR 模板。
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