酵母菌落PCR方法

酵母DNA的提取

1、x新鲜的菌体中加入150ul（200ul）bufferiI25(30)ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。

2、离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul

3、加入25ul，10%SDS。65度，30min水浴。

4、加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分钟（4度冰箱放置就可以）

5、12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不要振荡，直接离心）

6、12000rmp，15min，弃上清。

7、150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min

8、将上清溶液转到干净的离心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min

9、加入等体积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中

10、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

11、bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA

12、bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 

13、bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA

14、筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法
 

酵母菌落PCR
1、酵母质粒和基因组DNAPCR模版的制备

取对数生长期酵母菌株1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存于－20度取1ul用于PCR

2、从平板上调取长势良好的菌落少许，悬浮于含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔，放置盖子因受热膨胀）水浴煮沸0.2.5.10min

3、利用微波炉快速制备酵母治理以及菌落取直径大于3mm的酵母干菌落，至于EP管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30ulTE振荡，13000r/min，离心2-5min，上清储存浴－20度，取1ul来作PCR
 

真菌DNA的提取方法改良

1、酵母活化后加入YEPD培养基，25-28度培养16-24小时，收集菌体

2、取少许新鲜的菌体，加入0.6ml缓冲液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。0.1ml蜗牛酶（30mg/ml），37度温浴60min

3、3000r/min离心10s，去上清，沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度，30min水浴。

4、加入0.3ml ，5mol/lKAC冰浴60分钟

5、10000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不要振荡，直接离心）在5000-6000r/min离心15s

6、沉淀用0.6ml缓冲液III10mmol/l tris，1mol/l EDTA溶解1000r/min，离心15min

7、上清液转移一个干净的离心管中，加入6ul10ug/ul），ran酶，37度，30min

8、加入等体积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中

9、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

后续试验思路
1、提取酵母DNA

2、作PCR

3、筛库的引物（上CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC
下：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT
因为这个引物的TM值很高，所以必须使用二次PCR

94度，3min，95度，20miao，68度3min，68度7min，15度15min

修改程序94度，3min，95度，25miao，50度25miao，72度1min30s，72度5min

4、利用T和B酶切（65度酶切）
Taq I（AGCT）  
10*Taq I Basal buffer  
0.1%bsa  
PCR产物  
灭菌水  
酶  
BsuRI(GGCC)  
R buffer  
模版  
灭菌水  
酶  
5、分出不同的片断
6、将DNA转到大肠杆菌中，然后提取质粒，测序或是使用抗生素筛选AMP，得到AD，kana得到BD

此文转载来源：丁香通