细菌的转化与平板筛选

实验原理
 

    感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl₂低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

 

    转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

 

    重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ'基因。lacZ'基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。

 

    任何携带着lacZ'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）诱导后，在含有Xgal（5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷）的培养基平板上形成蓝色菌落（半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝）。

 

    而当有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而显蓝色，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

 

实验步骤
 

1.  制备感受态细胞

 

（1）吸取15 μl E.coil菌液，接种于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，待OD₆₀₀=0.5左右将该菌悬液以1：50接种量转于50 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20~30 min 测一次OD₆₀₀，至OD₆₀₀=0.6左右，停止培养。
 

（2）培养液转入离心管中，在冰浴10 min，4℃下5000 rpm 离心10 min。
 

（3）弃上清液，用4 ml 冰预冷的0.1 M CaCl₂溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置30 min。
 

（4）4℃下5000 rpm 离心6 min。
 

（5）弃上清液，用2 ml 冰预冷的0.1 M CaCl₂溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。
 

（6）以上制好的感受态细胞悬液可在冰上放置，24小时内直接用于转化实验，也可加入15%高压灭菌过的甘油，混匀后，分装于1.5 ml 离心管中，每管100 μl 感受态细胞悬液，置-70℃条件下保存。.
 

 

2.  质粒DNA转化大肠杆菌

 

（1）取100 μl 摇匀后的感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入5 μl 连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30 min 后，于42℃IPT****浴中保温90 s，然后迅速在冰上冷却2 min。
 

（2）加入900 μl LB液体培养基，则总体积约1 ml，混匀于37℃振荡培养90分钟使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性Ampr。
 

（3）在预制的LB琼脂平板上，加40 uL 20 mg/mL 的Xgal和4 uL 200 mg/mL 的IPTG溶液，并用灭菌玻璃推子（酒精灯上烧后冷却），均匀涂布于琼脂凝胶表面，37℃倒置吸收。
 

（4）将恢复培养的菌体4000 rpm离心5 min，移去上层900 μl LB培养基，用余下的100 μl重悬菌体至均匀。

 

3.  α互补现象的检查

 

    将重悬菌体均匀涂布于含X-gal加IPTG加氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养12~24 h，出现菌落。其中白色菌落从理论上讲为重组克隆。

如果进一步验证，可挑取多个白色菌落分别接种到1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养6~8 h，然后提取质粒酶切验证，或进行菌落PCR扩增鉴定。
 

 

注意事项

 

1.  细菌生长状态和密度：不要用经过多次转接和贮存于-4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细菌生长密度则以刚进入生长对数期为好。