VSVG假型逆转录病毒的生产
2016-05-25来源：未知
带有水疱性口炎病毒（vesicularstomatitisvirusG，VSV-G）蛋白的假型逆转录病毒载体已被证明可将基因高效递送到各种细胞中。其效率受相对细胞的生长速度以及细胞膜上的磷脂酰丝氨酸的水平影响。
一、材料与试剂
1. DMEM（GIBCO，11995-065）
2. 胎牛血清FBS（GEMBIO900-108）
3. 青霉素/链霉素溶液（GIBCO15140-122）
4. NaCl（SIGMAS7653）
5. HEPES（SIGMAH7523）
6. Na2HPO4（SIGMAS7907）
7. CaCl2（SIGMAC5080）
8. 氯喹，Chloroquine（SIGMAC6628）
9. Nabutyrate（SIGMAB5887）
10. Gag/pol（CellbiolabsRV-111）
11. VSVG和逆转录病毒载体（Clontech631512）
二、设备
1. 24孔板
2. 离心机
3. 水浴
三、实验步骤
1. 第1天：将健康的293细胞置于10 cm 组织培养板中。（10 ml 培养基中每孔7×106细胞）
2. 第2天：
（1）准备Ca-P（calcium-phosphate）转染液。
（2）加入2×HeBS（pH7.0）450 μl 到Ca-P转染液中并持续涡旋混匀。
（3）用包含最终浓度25 μm 氯喹的新鲜的DMEM培养基更换细胞培养液。
（4）逐步对细胞撒上900 μl 逆转录病毒载体混合物，并于37°C，孵育细胞。
（5）3-4 h 后，用新鲜的DMEM培养基更换细胞培养液，添加终浓度为10 μm 的丁酸钠，并于37°C，孵育细胞。注意：必须在12-14 h 后移除。
3. 第3天：用新鲜的DMEM培养基更换含有丁酸钠DMEM培养基，并于32℃，孵育细胞过夜。
4. 第4天：收获病毒上清并储存于4℃。之后向细胞中加入新鲜的DMEM培养基并继续于32℃，孵育细胞。
5. 第5天：重复第4天。放置健康的293细胞供第二天tittering使用。
6. 第6天：重复第4天。聚集所有上清并通过0.45微过滤器过滤。（如果需要高tittering病毒，于4°C，25 000 RPM离心3 h。小心移除上清，并用少于0.5 ml 的重悬病毒颗粒）。
7. 加入5 μl 浓缩病毒至293细胞中（50%融合）供tittering检测。用干冰冻结或乙醇浓缩病毒并储存在-80℃。
此文转载来源：丁香通
