人肝恶性淋巴瘤裸小鼠原位和皮下移植模型的建立实验
人肝恶性淋巴瘤裸小鼠原位和皮下移植模型的建立可以:(1)探讨肝恶性淋巴瘤发病机制;(2)为实验治疗提供工具;(3)为肝脏恶性淋巴瘤病因学和发病机制提供实验研究用的肿瘤动物模型。
实验方法原理
采用人肝恶性淋巴瘤术中新鲜组织块分别植入裸小鼠肝实质内和肩胛间皮下, 观察原位移植和皮下移植成瘤率, 移植瘤的侵袭、转移;并进行形态学( 光镜、电镜、免疫组织化学) 、血清学[ 甲胎蛋白( AFP) 、乙型肝炎病毒表面抗原( H BsAg) 、乳酸脱氢酶( LDH) ] 检测,染色体核型和流式细胞分析。
实验材料
试剂、试剂盒
RPMI-1640 培养液 碘酊 酒精 在戊巴比妥钠 CD3抗体 CD7抗体 CD19抗体 CD20抗体 CD45RO抗体 CD79a 抗体
仪器、耗材
实验步骤
一、实验动物准备
二、标本来源
2. 手术证实为肝多发结节型淋巴瘤,肝脏右叶呈多发性瘤结节,左叶由多个瘤结节融合为5. 3 cm ×3. 5 cm × 3. 0cm 肿块,切面灰白色鱼肉状, 结节中间部分黄白色,周边有红色不规则的充血带。
3. 术中未见其他组织、器官侵犯或远处淋巴结被累及,取肝左叶肿瘤结节病理诊断为肝脏非霍奇金B 细胞源性恶性淋巴瘤;慢性肝炎。
三、标本处理
四、皮下移植
用2. 5% 碘酊和75% 酒精消毒裸鼠背部皮肤,用无菌套管针抽吸2 粒1 mm ×1 mm ×1 mm瘤组织块, 行颈背部皮下组织移植。
1. 裸鼠在戊巴比妥钠( 30 mg/ kg ) 静脉注射麻醉下, 取左上腹横切口, 暴露肝脏, 切开肝左叶被膜, 将2 块1 mm ×1 mm ×1 mm 瘤组织块植入肝实质内,10-0 无损伤线缝合肝被膜,7-0 丝线缝合腹膜, 5-0 丝线缝皮。
2. 术后,继续饲养, 逐日观察肿瘤生长情况。
1. 当荷瘤裸鼠处于濒死状态时,取其中一只荷瘤裸鼠用颈椎脱位术处死, 系统解剖,取出移植瘤。
2. 取出的移植瘤一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续传代, 每次传代裸鼠5~10 只不等; 另一部分瘤组织液氮冻存备用,并被用做相关指标检测。
3. 其他荷瘤裸鼠饲养至濒死状态或自然死亡,以观察其肿瘤的生长、侵袭和转移。
(1)全部被处死和自然死亡的荷瘤裸鼠均经详细解剖学检查, 并记录肝内肿瘤,皮下移植瘤生长情况。
(2)淋巴结取材包括:髂动脉旁、髂动脉间、纵隔、肠系膜、幽门、贲门和肝门淋巴结等; 肺、肝、脾、肾、脑等器官常规取材,所有组织均经10% 中性甲醛固定, 石蜡切片,苏木精、伊红( H E) 染色, 光镜观察。
2. 免疫组织化学染色
采用LSAB 法,对全部裸鼠肝肿瘤切片用CD3、CD7、CD19、CD20、CD45RO、CD79a 抗体进行免疫组织化学染
移植瘤组织以2. 5% 戊二醛和1% 锇酸双固定, Epon-812 包埋, 超薄切片,铀- 铅染色,PHILIPS-CM10透射电镜观察。
AFP 放免法; 乙肝标志:HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAgELISA 法; LDH-L 法。
采用美国FACS-420型流式细胞仪, 对正常肝细胞、瘤源标本、移植瘤细胞进行DNA 含量测定。
采用短期培养,不加有丝分裂刺激方法,收获细胞常规制片,GTG 法染色,显微镜下观察。
采用2001 年新的WHO 分类方法。
8. 统计学处理
差异显著性采用t 检验, 数据以以x±s 表示,在SPSS10. 0 统计软件上完成。
综上所述, 所建立的人肝原发性恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型出现高的肿瘤移植生长率和肝内出现广泛播散的原因为: ( 1) 肿瘤细胞本身的高侵袭恶性潜能; ( 2) 与移植部位微环境因素有关、如肝的特殊结构、丰富的淋巴、血液循环、生化及免疫学特点等。正是由于裸鼠肝微环境与人肝相似, 使植入的肿瘤出现类似于人肝原发性恶性淋巴瘤体内的播散过程,为肝原发性恶性淋巴瘤的基础和临床研究提供了理想的动物模型平台。
此文转载来源:丁香通