基因合成实验
2016-05-25来源:未知
获得一段特需列的最直接的方法就是化学合成。本方案是利用成对的寡核苷酸, 通过其3’端的退火而生成一短的双链区,寡核苷酸既作为模板,又起引物的作用,长达 400 bp 的所需片段通过一步反应即可合成。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 将两种寡核苷酸各1 μg加入微量离心管中,加水至17 μl,再加2 μl 的10×测序酶缓冲液。70℃加热5 min,然后在合适的退火温度下保温5 min,取2 μl 留待以后的分析。
2. 加2 μl 4种dNTP混合液和10 U测序酶,30℃温育30 min。
3. 70℃ 10 min 灭活DNA聚合酶,取2 μl 留待以后的分析。
4. 加10×限制性内切酶反应缓冲液,加水和20~100 U 的适合于克隆的限制性内切酶至100 μl。适当的温度下消化2 h 以上。
5. 酚抽提,加100 μl 4 mol/l 乙酸铵和400 μl 的无水乙醇,-70℃沉淀15 min,离心5 min,沉淀重悬于100 μl TE缓冲液,用乙醇再沉淀一次,用95%乙醇洗涤沉淀,干燥,20 μl TE缓冲液溶解,取2 μl 用于以后的分析。
6. 用筛分型琼脂糖凝胶电泳分析确证原材料、延伸产物和酶切产物,估计延伸的寡核苷酸的量,再用适当的载体亚克隆。
7. 对几个合适的亚克隆测序。
此文转载来源:丁香通