膜上胰岛素受体数量的测定实验

胰岛素可高亲和性地与其受体结合（KD~109mol/L)，这一能力使我们能估测出甚至是相当粗制的制备物中的胰岛素受体数。

试剂、试剂盒         

结合缓冲液 [125I] 胰岛素 (受体级) 牛血清白蛋白猪胰岛素

实验步骤  

      

材料

 

牛血清白蛋白（BSA，1%)

 

猪胰岛素〔17.5/umol/L(0.1 mg/ml) 于 0.001mol/LHC1 中〕（如 Sigma Chemical Co.13505)

 

[125I] 胰岛素 (受体级)(DuPontNEN NEX 196)(2200uCi/mmol，35.5nmol/L)

 

试剂

 

结合缓冲液（供两点结合试验法用)

 

(配方，见“试剂的配制” PP.234~240)

 

操作程序

 

1) 于两只微量离心管中各加 40ul 大鼠肝的质膜（20 mg/ml), 记作#1 和#2。

 

2) 各管加 30ul 1%BSA。

 

3) 各管加 140ul 结合缓冲液 。

 

4)#2 管中加 60ul 17.5umol/L 猪胰岛素 (使终浓度为 3.5umol/L）,#1 管中加 60ul 蒸馏水。

 

5) 各管加 30ul 5nmol/L[125I] 胰岛素（使 [125I] 胰岛素的终浓度为 0.5nmol/L)。

 

6) 离心管置旋转摇床上室温孵育 2 h，或 4°C 孵育 16 h。

7) 离心管置微型离心机中离心 20 min。尽可能多地取出上清。

注：如配体对受体亲和性高（如 KD=10-11), 可洗涤沉淀以去除游离的配体。不过，若配体对其受体只有低的或中度的亲和性，则洗涤可能会部分解离配体-受体复合物。

 

8) 用 y-计数器测量管中的放射性强度。从#1 管的 cpm 值（总 cpm 值) 减去#2 管的 cpm 值（非特异结合计数和本底计数)，即得特异结合 cpm 值。

 

胰岛素结合量的计算

 

激素-受体相互作用的标准公式通常表示为:

 

 

 

式中，[H] 是游离配体的浓度，[R] 是游离受体的浓度，[HR] 是激素-受体复合物的浓度。达成平衡时，解离常数为

 

 

 

因此，[H] = [H]t - [HR](式中 [H]t 为配体的总浓度)，[R]t = [R] + [HR] (式中 [R]t 为受体的总浓度)。重排等式，则可得 KD 为：

 

 

 

对于两点结合试验，可假设鼠肝胰岛素受体的 KD 为10-9mol/L。于是，可根据测出的 [HR] 和 [H] 计算出受体的总浓度 [R]t。

为确定比活性，可由“胰岛素结合量”除以样品中的蛋白量，或由 [R]t 除以试管中的蛋白浓度得出。此计算结果通常以 pml(结合胰岛素)/mg(蛋白）来表示。

               此文转载：丁香通