高效液相色谱之高效反相液相色谱
(一)实验目的
(二)材料和试剂
1,仪器:高效液相色谱仪,Beckman公司gold system.
⑵ 规格:250×4.6mm
(三)样品准备
取待分析的huBPP,称量,用0.1%的TFA液溶解,配制成浓度大于1mg/ml的液体。必要时过滤或离心。
(四)操作
1、液体准备:A液0.1%TFA,B液液,99.9%乙腈,0.1%TFA,脱气。
2、开机
3、上柱
4、输入参数
B液:99.9%乙腈-0.1%TFA
洗脱条件:0-100% B 20min
5、平衡色谱柱 一般反相柱都保存在甲醇中,应置换出甲醇,用A液平衡色谱柱,待基线平稳后准备上样。必要时,可按洗脱条件不上样运行一遍程序,以洗出色谱柱可能存在的杂质。
6、上样,取20цl样,注入上样阀,将阀门扳下,即上样。
7、进行分离,鉴定。
8、打印结果,并分析,可得到峰数,峰高,面积百分比,保留时间等参数。
附:色谱柱操作说明,(以迪马公司Diamonsil(TM)柱为例)
1. 色谱柱常规参数
订货号:Catalog.No. 产品专利号 Serial No.
出厂日期 Date
填料 Column Paking 如,Diamonsil(TM)钻石C18 5цm
柱规格 Column Dimension 250×4.6mm
填料批号 Material Lot No. 0206
保证柱效 Guarantee Plate Number N>70,000/m(usp 1/2 Peak height)
不对称因子 Asmmetry Factor As=0.8-1.4(5% Peak height)
2. 验收色谱柱
⑴ 检查色谱柱外观是否完好。
3. 流动相使用
⑴检查色谱柱允许使用流动相及pH,如,凝胶柱常规用缓冲液,反相柱用有机溶剂,钻石C18柱允许pH为2-7.5。
⑵ 注意流动相的粘度对柱后的影响,如甲醇/水系统高于乙腈/水系统。
⑶ 流动相、样品使用时过滤,常用0.45μm膜,分清水溶性和脂溶性膜。一般在色谱柱口有0.2μm的膜保护,以免堵塞色谱柱。
4. 色谱柱安装
⑴ 确证柱与仪器的接头,管路匹配。
⑵ 安装柱之前,检查流路系统中的溶剂是否正常。
5. 对样品要求
⑴ 样品应与流动相互溶。
⑵ 样品浓度要在一定范围内,不同色谱柱要求不同。
⑶ 样品中不能有不溶物,用前应用针头或过滤器过滤。
⑷ 样品不应与流动相发生反应。
6. 色谱柱的使用
⑴ 色谱柱最后封装的溶剂一般与检测报告相同或特别注明,若更换流动相时,流速要慢,一般不超过0.5ml/mim。
⑵ 请勿频繁改变流动相,否则,会加速降低柱效。
⑶ 注意不同色谱柱耐压程度不同,压力要在柱耐压范围内,为获得最佳分离效果,钻石C18柱使用勿超过200bar(300psi)。
7. 色谱柱的保存
⑴ 若流动相中使用盐或酸试剂,保存前应先用水冲洗干净(约20倍柱体积)。
⑵ 泵入保存液,不同色谱柱用不同保存液,钻石C18柱应尽可能用100%乙腈或甲醇保存。
8. 柱的再生
不同柱用不同方法再生,请参看各种色谱柱说明。
钻石反相键合相C18、C8、pH、CN柱用以下程序:
用20倍柱体积的溶剂按下列程序冲洗色谱柱。(按箭头方向冲)
水→甲醇→氯仿→甲醇
水冲洗时可用热蒸溜水(55℃)或加入少量(0.8%)DMSO冲洗。
一般情况下不提倡反向冲洗色谱柱,必要时可反向冲。
此文转载:丁香通