异硫氰酸胍/氯化铯超速离心法制备 RNA 实验
这种方法源自于对 Chirgwin 等(1979) 所拟方案的修改。对 Chirgwin 等所规定的试剂,许多试剂盒中常用,且用于分离和纯化 RNA 的试剂也是常见的。
实验材料
细胞和组织
试剂、试剂盒
氯仿氯化铯溶液二硫苏糖醇EDTA乙醇异硫氰酸胍裂解缓冲液异丙醇N-月桂酰肌氨酸氯化锂液氮β-巯基乙醇苯酚
仪器、耗材
离心机和转子研钵和杵超速离心管
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
氯仿
氯化铯溶液,5.7mol/L(5.7mol/L 氯化铯,25 mmol/L 醋酸钠,pH6.0,1mmol/LEDTA,pH8.0)
用焦碳酸二乙酯(DEPC) 处理过的水
二硫苏糖醇(DTT),0.2 mmol/L
EDTA,1mmol/L,pH8.0
乙醇,70%(体积分数)
异硫氰酸胍裂解缓冲液 (4mol/L 异硫氰酸胍,25 mmol/L 醋酸钠,pH6.0,1mmol/LEDTA,pH8.0)
异丙醇
N-月桂酰肌氨酸,20%(200 g/L)
氯化锂(LiCl),8mol/L
液氮
β-巯基乙醇,10 ml/L
苯酚, 水饱和,pH4.0
2. 离心机和转子
BeckmanTi50 转子或相当的转子
3. 特殊设备
研钵和杵,用 DEPC 处理过的水洗涤,预冷
超速离心管(异质同晶共聚材料),或相当的 Polygon, 或相当的高速匀浆器
4. 细胞和组织
细胞/组织,冻于液氮
二、方法
1. 使用研钵和杵在液氮下将样品研磨成细粉。使用 Polygon 均化器或其他合适的器具在 7 ml 胍裂解缓冲液中均质化组织或细胞(达 1X109 个)。
2. 将 4 ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液加到超速离心管中。
3. 将 1ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液、120ul10mol/L 的沒-巯基乙醇和 240ulN-月桂酰肌氨酸加到裂解产物中。
4. 将氯化铯/裂解产物混合物混合,小心使之位于离心管中的氯化铯溶液上分层。
5.20°C 下 180000 g 离心 21 h。
6. 移弃氯化铯上清液,小心避免扰动管底的 RNA 沉降物。
7. 小心将 RNA 沉降物再溶解于 750ul 异硫氰酸胍裂解缓冲液中。
8. 加等体积酚,混匀。
9.10000g 离心 15 min。
10. 将水相转移到一新管中。重复水相的酚抽提,直到界面变清。
11. 向清澈的水相加 1 倍体积氯仿。
12. 混合,l0000 g 离心 l0 min。
13. 将水相转移到一干净试管中。加等体积的异丙酵和 1/10 体积 8mol/L 的氯化锂。10000g 离心10min。
14. 移弃上清液。用 750ul70% 乙醇洗涤 RNA 沉降物,10000 g 离心。
15. 移弃乙酵,风干沉降物,再溶解于 50~500ul0.2 mmol/L 的 DTT 中。
16.RNA 储存于-70°C。
此文转载来源:丁香通