你会遇到的各种色谱柱问题

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色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此，担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成，没有色谱柱就不能进行分离、定性与定量了，色谱柱是根据柱子里的填充物不同来区别的，填充物又是根据需要分离的物质的极性来选择的。。。

 

液相色谱柱的使用方法：

 

1.色谱柱的使用说明：

（1）色谱柱使用前注意事项：

色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如，用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

（2）流动相：

流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。以常规硅胶为基质的键合相填料通常的pH值适用范围是2.0～8.0，BDSC18适合于碱性化合物，pH值适用范围为2.0～10.0。当必须要在pH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。

（3）样品：

样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；

若样品不便处理，要使用保护柱，在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。

 

2.色谱柱的保存：

（1）反相色谱柱每天实验后的保养：

使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

（2）长期保存色谱柱：

如，色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上，储存的温度最好是室温。

 

3.色谱柱的再生因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。

（1）反相柱的再生：

依次采用20～30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90（V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。

（2）正相柱的再生：

依次以20～30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

 

4.色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：

（1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

（2）色谱柱头的填料被样品污染；

（3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；

（4）流动相pH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

 

解决办法如下：

（1）如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

（2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

（3）如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

（4）如果因pH值使用不当，很难恢复。

 

液相柱：

卡套柱的安装（不加预柱）

1.将卡套架套入柱芯

2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图）

3.将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片

4.将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧

5.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

6.连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手

 

注意：

使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清

洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。

 

卡套柱的安装（加预柱）：

1.将卡套架套入柱芯；

2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯；

3.将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片；

4.将“子弹头”预柱放入卡套片内；

5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧；

6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手

更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱）

 

注意：

在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。

1.将修补工具中的2套入柱芯的顶端；

2.将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧；

3.一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网；

4.用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料；

5.将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平；

6.照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端；

7.柱芯顶端套上2，然后将滤网放入；

8.压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平；

 

【如何平衡色谱柱？】

平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）

 

色谱柱的再生

 

进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。

注意：

在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此，应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

 

色谱柱的维护

 

1.使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）；

2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围；

3.避免流动相组成及极性的剧烈变化；

4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理；

5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中；

6.压力升高是需要更换预柱的信号；

 

色谱柱贮存

 

当毛细管色谱柱从GC拆下时，应该贮存在原来的盒子里。将GC隔垫插在柱两端以防止碎片进入柱内。一旦要重新安装色谱柱，则需要从柱头截去2-4厘米以确保隔垫碎屑不会堵塞在柱子内。

色谱柱的安装一般看仪器说明书就行了，各气体流速的设置要根据具体需要设置，如何老化也可查资料获得，重要是在使用过程中的维护。曾发生过有人将空气瓶当氮气瓶换上，使用者又不能及时发现，以为柱子受污染，就升温老化，从而报废了一条50米FFAP和一条60米INNOWAX毛细柱，所以要重视维护。色谱柱用过一段时间后可将检测器和进样器两端调换过来安装使用。

 

液相色谱柱的使用注意事项:

1.注意使用的PH范围,硅胶柱的范围较窄多为3-8,但耐高压;基质为聚合物的耐高压性能不如硅胶柱,但他的PH使用范围很宽,多为1-14.

2.注意柱子的疏水性能,以免造成柱子的塌陷.

3.注意流动相盐度,以免损伤仪器.

4.柱子长时间不用以及每次使用前后都要冲洗.

5.要依据样品的成分选用合适的保护柱.

  

气相色谱柱之柱子的老化

 

确保载气流过毛细管柱15~30min；

缓慢程序升温（5℃/min）到老化温度；

最初老化温度≥4hours；

如果柱子受到污染。可在推荐的最高色谱柱温度低20℃的条件下，老化柱子；

 

一般推荐的老化温度为：

Tcond = Tmax/2+Tapp/2；

这里：Tcond=老化温度；

Tmax=色谱柱推荐采用的最高温度；

Tapp=应用中使用的最高温度；

 

在老化柱子时，一定不要将毛细管接在检测器上，应将那一端放空，同时将检测器用闷头堵上。如果是FID，容许接在上面，但应该将检测器温度升上去。

 

对色谱柱升至一恒定温度，通常为其温度上限。特殊情况下，可加热至高于最高使用温度10～20度左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后，记录并观察基线。初始毛细管柱

•WCOT-内表面涂有很薄的固定相.

•PLOT-内表面涂有多孔的固体层或吸附剂

•SCOT-内表面先涂固态载体，然后再涂上固定相。

由于毛细管色谱柱柱效很高，对一般的样品备用三种极性的柱子就能解决大部分问题，但对同分异构体要严格选用专用毛细管色谱柱。

 

【色谱柱的选择】

 

按样品极性选择:

弱极性样品：可选OV-1，SE-30，OV-101，SE-52，SE-54。

中极性样品：可选OV-17，OV-1701，XE-60，OV-225，OV-210。

极性样品：可选PEG-20M,FFAP,OV-275,DEGS。

 

按酸碱性选择:

碱性样品：弱碱性可选OV-1，SE-30等；

强碱性可选碱性PEGB《br》

酸性样品：FFAP

按沸点选择:

高沸点物质可选OV-1，SE-30，SE-54等交联柱，薄液膜

 

毛细管内径的选择

成品分析：小口径 0.25mm，0.32mm ，薄液膜；

 

痕量组分分析：大口径，厚液膜，0.53mm；

※汽化温度：比样品沸点高20～30℃；

※柱温：首选在样品沸点的0.7倍处，再看分离情况调整；

※检测温度＞柱温＞120℃（FID）；

※分流比：小口径＞100:1 ；大口径10～50:1或不分流进样（用专用接头）；

※尾吹：15～30ml/分（满足FID要求）；

※隔膜清扫气：1～5mL/分；

※进样量：0.3～0.5μl；

※定性与定量；

定性与填充柱色谱一样，或GC/MS量，一般用归一法或内标法定量。

 

操作步骤：

1)取出记录本登记使用者和开始时间。

2)打开净化器上的载气开关阀，然后检查是否漏气，保证气密性良好。

3)调节总流量为适当值（根据刻度的流量表测得）。

4)调节分流阀使分流流量为实验所需的流量（用皂膜流量计在气路系统面板上的《SPLIT VENT》实际测量），柱流量即为总流量减去分流量。

5)调节尾吹流量控制阀使尾吹流量为适当值，并使尾吹流量与柱流量之和不低于载气总流量。

6)打开净化器的空气、氢气开关阀，调节空气、氢气流量为适当值。

7)根据实验需要设置柱温、进样口温度和FID检测器温度。

8) FID检测器温度达到150oC以上，按FIRE键点燃FID检测器火焰。

9)设置FID检测器灵敏度和输出信号衰减。

10)如果基线不在零位，调节调零电位器A使FID输出信号在纪录仪或积分仪零位附近。待所设参数达到设置时，即可进行分析。

11)待所设参数达到设置时，即可进样分析。

 

注意事项：

1)详细阅读使用说明由负责人考核后方可独立操作；

2)各种气体流量在摸索出最佳条件后可固定使用；

3)仪器每次使用应详细登记；

 

气相色谱柱的选择

 

增加柱长可提高分离效果，但柱长过长，使分析时间延长，所以在满足一定分

离度的条件下，应选用尽可能短的色谱柱。填充柱的柱内径一般为3~6 mm，毛细管柱的内径0.1~0.5 mm。

 

固定液的用量选择：

担体的表面积较大时，固定液用量可多些，允许的进样量也相应增加。但从速率方程式的传质项中可知，为了减小液相的传质阻力，应使固定液的液膜厚度尽可能薄，但固定液液膜太薄，则允许的进样量也就越少。因此固定液的用量要根据具体情况决定。

 

固定液的配比选择：

（指固定液与担体的质量比）一般为5:100到25:100。担体比表面积越大，固定液用量的比例可能越高。

 

担体的性质和粒度选择：

若担体的比表面积大，孔径分布均匀，则固定液易分布均匀，从而可加快传质过程，提高柱效。故应该选用颗粒小且均匀的担体，并尽可能填充均匀，以减少涡流扩散，提高柱效。但粒度过小，填充不易均匀，会使柱压降增大，对操作不利。一般对4~6mm的柱管，选用60~80目或80~100目的担体较为合适。