RNA提取遇到问题了？那你需要看看这儿

之前我们推出了有关RNA研究的在线讲座，讨论了从样本的稳定、破碎到RNA纯化需要注意的重点，随后我们收到了很多参加者的提问。在本文中我们将对RNA提取最常见的5大类问题作出深入的解答，一定会让你的实验技能更上一层楼。

 

 

1

当处理细菌，血液或FFPE样本时，需要特别注意哪些方面？

不同样本的RNA含量不同，同时这些样本中可能存在污染物或抑制剂，从而影响RNA的提取。因此在针对这些样本类型时应当注意：

 

细菌

细菌 mRNA 非常不稳定，即使在快速繁殖期，其 mRNA 的平均半衰期也仅为3分钟。有时细菌的 mRNA 甚至仍在翻译，降解就已经启动了。这种快速的降解使对基因表达的研究困难重重。为了保证基因表达模式能被准确保留，且最大程度提取到完整的 mRNA ，我们推荐在样本处理前进行样本的稳定，QIAGEN 的 RNAprotect Bacteria Reagent可实现对 RNA 的有效稳定。

 

血液样本

全血中的 RNA主要来自于白细胞，因为人类的红细胞中不含有核酸。在健康人的全血中，红细胞的数量约是白细胞的1000倍，因此去除红细胞可极大简化对 RNA 的提取。红细胞由于其特性极易在低渗环境中破裂，因此利用该性能可实现选择性地裂解去除红细胞。从全血中纯化细胞 RNA ，推荐QIAamp RNA Blood Mini Kit。

 

此外，为了获得具有良好重复性的基因表达分析结果，在血液的采集、运输以及储存的过程中，对 RNA 的稳定十分重要。PAXgene Blood RNA Kit 和 RNeasy Protect Animal Blood System 分别针对人血和动物血液中的RNA提供快速可靠的稳定。

 

FFPE 组织样本

对于FFPE样本，推荐使用RNeasy FFPE Kit进行RNA的提取。

FFPE 样本中的核酸由于固定和包埋的处理条件，极易发生严重的片段化，且福尔马林也会引起核酸的化学修饰。为了减小 FFPE 保存对 RNA 转录本带来的影响，提取 RNA 时需要注意以下几点：

采集组织样本后需要尽早固定

组织样本的厚度不要超过 5mm，固定时间最长不要超过 24h

采用高质量的试剂进行石蜡包埋

可能的话避免样本染色，或采用对RNA 质量影响小的染色程序，例如甲酚紫染色

RNA 的提取需要逆转福尔马林造成的交联

 

如果您还处理其他的样本类型，推荐您查看RNA提取指南 （Guide to specialconsiderations in RNA purification）。

 

2

提取好的RNA进行长期保存时需要注意什么？

RNA 长期稳定的保存极大地取决于RNA的纯度。我们推荐纯化后的 RNA 保存在–20°C 或–70°C的 RNase-Free 水中。在我们的实验中，该条件下保存的RNA 可稳定保存1年。在 –70 到 –80°C的保存条件下，RNA 甚至可以放置五年以上而不发生降解。

 

3

如何确保起始样本已被充分破碎呢？

在纯化 RNA 前，起始样本的充分破碎和均质十分关键。高效的破碎可破坏样本的组织结构，细胞壁和细胞膜，有利于 RNA 的充分释放；均质可降低细胞破碎后的粘度，有利于 RNA 的纯化，这两个步骤可结合或分开进行。有一些破碎的方法可同时实现均质，而另一些则需要额外的均质化步骤。

 

在样本破碎与均质手册（Guide to disruptionand homogenization methods for different samples）中，介绍了针对不同起始样本的破碎和均质方法。您可根据您的起始样本，参考本手册中的建议，选取合适的破碎均质方法。

 

此外，根据您的特殊需求，QIAGEN的TissueLyser II, TissueLyser LT以及Tissue Ruptor可帮助您快速高效的进行样本破碎。

 

4

gDNA污染如何去除？

基因组 DNA 污染对RNA下游应用带来了很多挑战。为了防止 gDNA 在实时RT-PCR 应用中带来的干扰，我们可以有几种办法。

 

引物设计

我们推荐将引物设计在内含子剪切处，这样 gDNA 将无法被扩增。

 

在纯化过程中将DNA去除

QIAGEN 的 RNeasy kits 使用不同的方法去除gDNA 的污染：

RNeasy Micro, Mini, Midi, Maxi and 96-well kits 中包含了RNase-Free DNase Set，可用于DNA的过柱酶消化；

RNeasy Plus kits 使用了 gDNA Eliminator spin columns；

RNeasy Plus Universal Kit 使用了gDNA Eliminator solution， 在有机相萃取时实现 DNA 的强力去除。

 

cDNA 合成时去除 gDNA

QIAGEN在逆转录试剂盒中包含了DNA 去除剂，可消除DNA 任何微量残留，例如QuantiTect RT Kit, QuantiFast 和QuantiNova kits 系列逆转录试剂盒。

5

QIAGEN的RNA提取技术有什么过人之处？

目前市面上有很多商品化 RNA 纯化试剂盒，毋庸置疑QIAGEN 是其中技术含量最高，产品最全面的。

 

经典系列：RNeasy Kits

QIAGEN RNeasy 系列试剂盒的操作简单快捷，同时包含了最优化的gDNA去除方案。以RNeasy Plus Mini Kits 为例：首先，含有高度变性异硫氰酸胍的Buffer RLT Plus 将细胞和容易裂解的组织裂解并均质化。同时，Buffer RLT Plus会立即将RNases 失活，以确保RNA的完整性。裂解物随后通过gDNA 去除离心柱，配合高盐缓冲液可选择性地并高效地去除gDNA。接下来，加入乙醇为RNA 与膜的结合创造适宜条件，随后样本转移到RNeasy 离心柱，QIAGEN 专利的硅胶膜柱可高效结合RNA。

 

RNeasy Plus Universal Kits

对于脂肪和难裂解的组织，推荐使用RNeasy Plus Universal Kits ，这款试剂盒可适用于所有组织类型。

 

针对高通量的RNA纯化，推荐使用RNeasy Plus 96 Kit。如果需要从样本中提取包含miRNA 的总RNA，miRNeasy Kits则非常适合。