千呼万唤！微生物实验室能力验证指南来了！

微生物实验室在参加能力验证过程中，人员培训、仪器设备、样品管理、实验方法、环境条件等几大必备因素都是考核的重点，需要重点关注、逐个突破才能整体提升微生物检测能力，从而提升质量管理水平，不断缩小与国内外先进微生物检测机构的差距。积极参与微生物能力验证对提高微生物实验室检测能和管理水平具有重要促进作用。
 
对于微生物检验工作而言，需从以下方面着手能力验证和质量控制工作：
参与微生物检测工作的管理与检验人员；
微生物检测过程中使用的各种仪器设备；
微生物检测过程中使用的培养基，质控菌株及样品；
微生物检测所采用的检验方法；
食品微生物检测过程中的环境。
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实验人员的能力及培训
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应由具有一定资质的微生物学或相近专业的人员来指导或操作微生物检测和能力验证。实验人员应具有相应的微生物专业培训经历，具备相应资质，能够理解相关标准或规范并正确实施检验。合格的微生物实验人员可以为顺利通过能力验证提供保障，反过来能力验证又可以评价并提高微生物实验人员的能力。

FEPAS171乳粉中菌落总数的能力验证和FEPAS177乳粉中大肠菌群计数的能力验证中，实验室管理者分别安排两位经验丰富的实验者进行检测，同时安排新进人员用液化后剩余样本平行试验，既锻炼考察新进人员的检测能力，又对试验结果进行了实验室人员间的比对。两组人员结果无显著性差异，结果满意。
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仪器设备的选择和维护

购买仪器前，充分调研尤为重要，尽可能选择技术先进、精度和准确度高、灵敏度和特异度高的设备。微生物实验室主要仪器设备有：干热灭菌器、高压蒸汽灭菌锅、天平、均质器、超净工作台、生物安全柜、水浴锅、培养箱、冷藏箱、冷冻柜、恒温水浴锅、显微镜、革兰氏染色仪、全自动病原微生物快速检测系统、PCR仪、全自动免疫荧光酶标仪、全自动细菌鉴定仪、FIR分光光度计、基质辅助激光解吸电离－飞行时间质谱仪等。
 
所有的仪器和设备均应按照国家相关法律法规的要求实施使用仪器设备的维护、校准和性能验证。
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1．培养箱
 培养箱温度的均匀性和准确性对微生物的生长影响较大，所以在首次安装使用培养箱时需对温度进行校准，并定期期间核查。
现在一般采用无线温度探头记录和保存温度数据，并有实时报警系统。
 
2．高压蒸汽灭菌锅
此为压力容器装置，压力表需送专门部门强检。操作需专业培训后持证上岗，并严格按照高压蒸汽灭菌锅说明书操作。灭菌锅需要用温度探头和嗜热芽孢杆菌等生物指示剂进行冷点、装载方式以及装载量等相关验证。
建议每次化学指示剂对灭菌过程的效果进行确认。另外，实验室应使用专门处理污染物的高压灭菌锅，以避免可能发生的交叉污染。
 
3．全自动革兰氏染色仪
染色为微生物表型鉴定的重要依据，为保证染色结果的准确性，每次染色时应同时用金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌作为质控菌株。革兰氏染色液应注意及时更换，保证其均在效期内。

4．FTIK分光光度计
FTIK法测定的是无损伤微生物的红外光谱，反应了全细胞组分的综合信息。由于这些细胞组分与基因表达有关，因此，所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信息。可通过构建环境菌FTIR谱库，实现对洁净室环境微生物的动态监控。

开展红外相似性分析的前提是建立良好的SOP操作，详细规定培养基、培养条件，传代次数、处理谱段等细节。

在药品微生物实验室红外相似性分析能力验证中，使用FTIR分光光度计检测，采用3000－2900cm-1，1200－900cm-1，1500－1400cm-1谱段处理，结果满意。
 
5．全自动病原微生物快速检测系统
该系统采用荧光定量PCR的方法，使用染料法和探针法对致病微生物进行快速筛查。每次试验时用阴性和阳性标准菌株做质控，因此仪器灵敏度高，应注意实验布局，防止气溶胶导致假阳性结果。严格按照使用指南，对于不同的食品基质，尤其是含有对PCR反应有抑制成分的食品采取不同的增菌程序。如大豆类制品中含有PCR抑制因子，沙门氏菌检测时－步增菌后上机，内控阳性呈现为阴性，应二步稀释增菌后检测。

图为酿造酱油沙门氏菌检测（一步增菌）。

FEPAS175乳粉中沙门氏菌定性检验的能力验证中，分别使用该仪器和常规法（GB4789．4）进行检测，结果均满意。
 
6.基质辅助激光解吸电离－飞行时间质谱仪（MALDI－T0F）
MALDI－T0F是－种新兴的快速可靠的微生物分类和鉴定方法，该仪器可广泛应用于微生物检验、科研、能力验证和实验室比对。IFCC-PT-005化妆品中金黄色葡萄球菌检验和食品中金黄色葡萄球菌检验实验室比对和NiroC-PT-026化妆品中铜绿假单胞菌检出能力验证中，我们对于疑似菌落分别使用全自动细菌鉴定仪和基质辅助飞行时间质谱仪鉴定，并分别用阳性标准菌株做质控，结果均满意，且干扰菌均与结果吻合。

图铜绿假单胞菌标准菌株与阳性样本分离菌株质谱图。
 
培养基、质控菌株及样品

1．培养基
培养基是人工配置的满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质，在微生物检测中起着非常重要的作用，其质量的好坏直接影响微生物检验数据的准确性。
培养基到货后，需按照相关标准进行验收。建议同时储备有两个或以上生产供应商合格的培养基。严格按照供应商提供的Ｃ藏条件、有效期和使用方法进行培养基的配制、灭菌、保存和使用。
FEPAS171乳粉中菌落总数的能力验证中，同时使用三家供应商的平板计数琼脂，计数结果经方差检验，无显著性差异（P>O．05），将其平均值上报，结果满意。
 
2．质控菌种
购买微生物菌种保藏专门机构或同行认可机构保存的、可溯源的标准或参考菌株。质控菌株在购回后，按相关要求进行验收后合理保藏使用。

3．样品
送达实验室的样品，为防止样品中原有微生物数量发生变化，应按标示在规定条件下储存和规定的时限检测。
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检测方法的选择

检验方法是微生物检验质量保证的重要步骤，检验方法的不同有些会造成检验结果的重大差异，有些则无显著性差异。优先按能力验证所附／指定方法进行检测。如无指定方法，可以采用实验室常用方法，也可以采用国际通用方法或其他方法。无论采用何种方法，在检验过程中设置阴性对照，防止因培养基及实验器具灭菌不彻底或人为操作不当等因素造成的检验结果不准确；设置阳性对照，以便更好的观察判断目标菌形态特征等；设置平行样，保证实验结果的准确性ｗ。

国家局组织的沙门氏菌盲样考核中，同时选用GB4789.4中血清分型法、核糖体分型（Ribotyping）和多位点序列分型（MLST）三种方法。
旨在用不同的分型方法确认血清型，同时熟悉日益发展的分子生物学手段。血清分型为实验室常规方法，对血清和操作人员的要求均较高。核糖体分型为早期使用的分子分型方法，多位点序列分型为上世纪末至今最为流行的方法。
 
结果表明，分子分型方法因受数据库的限制，其鉴定成功的血清型少于较为成熟的血清分型，但在每个阳性样本中均成功鉴定一种血清型，结果满意。
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环境布局和设计

微生物实验室的布局与设计应充分考虑到试验设备安装、良好微生物实验室操作规范和实验室安全的要求。
实验室布局设计的基本原则是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止检验过程对人员和环境造成危害，同时还应考虑活动区域的合理规划及区分，避免混乱和污染，以提高微生物实验室操作的可靠性。病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室进行。
定期对洁净室等受控环境微生物污染情况进行监测和控制，对收集到的浮游菌和沉降菌等原始分离菌株（野生菌株）进行系统、完整的菌株信息记录，包括分离时间、来源，表型及分子鉴定的主要特征等。
CNAST0781药品无菌检查（薄膜过滤法）能力验证中，五个样本中有两个疑似阳性，将疑似阳性结果分离纯化，菌株鉴定为枯草芽孢杆菌和黑曲霉，均未在环境菌库和操作人员接触皿分离菌中匹配到，判定为阳性。结果满意，且报告表明鉴定结果与实际污染菌株完全一致。
 
小结
实践证明，对于微生物实验室，科学有效的质量管理体系，能够保证微生物检验队伍素质的提升，配备高精尖的仪器设备，对于参与微生物能力验证、建设微生物重点实验室和提高实验室的检测能力与管理水平具有重要促进作用。